Separação do envelope celular para bactérias gram-negativas em frações de membrana interna e externa com ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

As bactérias gram-negativas produzem duas membranas que são separadas por um espaço periplasmático e uma parede celular peptidoglicana¹. A membrana interna (IM) envolve o citosol e é um bicamada simétrico de fosfolipídeos. Peptidoglicano protege contra a pressão de turgor e fornece a bactéria com uma forma celular, e é anexado à membrana externa (OM) por lipoproteínas^2,3. O OM envolve o periplasma e é predominantemente assimétrico. O folheto interno consiste em fosfolipídios e o folheto externo consiste de glicolipídios conhecidos como lipooligossacarídeos (LOS) ou lipopolissacarídeos (LPS)^4,5. A assimetria lipídica e a bioquímica das moléculas de LOS/LPS no folheto externo conferem propriedades de barreira à superfície celular que protegem a bactéria contra perigos em seu ambiente^6,7.

As moléculas de LPS são compostas por três constituintes: o lipídio A disaccharolipid, o oligossacarídeo central, e o O-polissacarídeo ou o-antígeno. Lipídico A é um disaccharolipídeo acylado multiplicado. Os oligossacarídeos principais consistem de 10-15 açúcares conhecidos como LPS bruto ou R-LPS. O núcleo é subdividido na região interna, composto por ácido 2-keto-3-desoxi-d-manno-octulosônico (kdo) e um ou mais resíduos de heptose, e uma região externa que consiste geralmente de hexoses (glicose ou galactose) e heptoses, ou açúcares de acetamido⁵. A região do núcleo externo é mais variável em seus componentes e estrutura do que o núcleo interno. Em Salmonella spp., apenas uma estrutura central foi descrita; no entanto, em Escherichia coli existem cinco estruturas centrais diferentes (designadas K-12, R1, R2, R3 e R4)⁸. E. coli K-12 DH5α, que usamos neste procedimento, carrega uma mutação que resulta na produção R-LPS⁹. As moléculas de R-LPS não possuem o moiety de antígeno O e têm um peso molecular semelhante às moléculas de LOS.

A adição de o-antígeno ao R-LPS transforma esta molécula em LPS suave, ou S-LPS. Os antígenos O são construídos a partir de subunidades curtas de 3-4 carboidratos e consistem em múltiplas modalidades com comprimentos de cadeia variados¹⁰. Algumas bactérias produtoras de LPS, como Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Tipilásurio), apresentar uma distribuição trimodal de moléculas de LPS em sua superfície^10,11. Os antígenos O de cadeia muito longa podem conter mais de cem subunidades e pesar mais de cem kilodaltons. Os antígenos O fornecem propriedades superficiais à bactéria que são necessárias para resistir aos antibióticos, evitar a predação por bacteriófagos e causar doenças.

Espécies de Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria e outras geram moléculas de LOS em vez de moléculas de LPS em sua superfície¹². As moléculas de LOS consistem em lipídios A e oligossacarídeos do núcleo, mas não possuem o antígeno O. Estes tipos de bactérias Gram-negativas modificam seus oligossacarídeos centrais com açúcares adicionais e combinações de açúcares para alterar as propriedades superficiais¹². Tanto os micróbios produtores de LOS quanto os de LPS derivam os fosfatos em lipídios A e moléculas do núcleo com moieties cationic⁷. Essas adições incluem substituições de fosfoetanolamina, galactosamina e aminoarabinose, que funcionam neutralizando a carga de superfície aniônica e, assim, protegendo contra peptídeos antimicrobianos catínicos. As bactérias gram-negativas também modificam a estrutura do oligossacarídeo central com substituições variáveis não estequiométricas de açúcares, ou moléculas extras de kdo, e alteram o número de cadeias de acilem nos disaccharolipídios^{lipídicos 7}.

A capacidade de isolar o IM do OM das bactérias Gram-negativas tem sido fundamental para compreender o papel do envelope celular na resistência antimicrobiana e na patogênese da doença^11,12. Derivações dessa abordagem têm sido utilizadas para deduzir mecanismos de montagem, manutenção e remodelação dos constituintes proteicos, fosfolipídios e glicolipídicos para o OM.

Nosso laboratório realiza rotineiramente análises lipidomicas bacterianas para estudar a regulação lipídica mediada por proteínas e a função lipídica em uma variedade de espécies Gram-negativas. Os volumes utilizados no protocolo refletem o uso rotineiro deste procedimento para analisar fosfolipídeos não rotulados por cromatografia de camada fina e cromatografia líquida tandem espectrometria de massa^13,14.

O protocolo começa expondo uma suspensão refrigerada de bactérias Gram-negativas a uma solução osmolar alta de sacarose e adicionando lysozyme para dissociar o OM da camada peptidoglicana subjacente(Figura 1)¹². O EDTA é então adicionado para facilitar a penetração do lisozime, uma vez que o sequestro de cátion divalente interrompe as interações de ponte eletrostática lateral entre moléculas de LOS/LPS adjacentes¹⁵. O protocolo original do qual o nosso foi adaptado exigiu a formação de esheroplastos, uma forma de célula bacteriana Gram-negativa que consiste em uma membrana plasmática e citosol, mas não possui a camada peptidoglicana e um OM. É possível que os esheroplastos sejam produzidos pelo método adaptado; no entanto, a técnica não confia ou pretende sua formação para o sucesso. Em vez disso, as bactérias tratadas com lysozyme-EDTA são rapidamente colhidas pela centrifugação e re-suspensas em uma solução de sacarose de menor concentração antes da lse pressurizada. Os OMs que poderiam ter sido liberados formando esferoplastos devem, em teoria, ser colhidos dos sobrenatantes das células tratadas, mas esta abordagem não é detalhada aqui. Em última análise, as células tratadas são submetidas à homogeneização e lice convencional, o que aumenta a eficiência e a reprodutibilidade do procedimento de separação da membrana¹⁶.

Após a lyse, as membranas totais são coletadas por ultracentrifugação e aplicadas a um gradiente de densidade de sacarose descontínua para fracionar os IMs e OMs. A abordagem clássica utiliza um gradiente mais contínuo que consiste em pelo menos cinco soluções diferentes de sacarose^11,12. O gradiente descontínuo em nosso protocolo consiste em três soluções de sacarose e divide as bicamadas em duas frações distintas¹⁷. As moléculas de LOS e LPS dentro dos OMs de bactérias Gram-negativas levam o envelope à partição em uma fração de IM de baixa densidade marrom superior e uma fração OM branca inferior de alta densidade(Figura 1 e Figura 2).

Acinetobacter baumannii são importantes patógenos humanos multidroga resistentes que produzem moléculas de LOS em seu OM e erguem um envelope celular difícil de separar^18,19. Trabalhos recentes sugerem que uma derivação do protocolo que apresentamos aqui pode ser usada para particionar as bicamadas desses organismos²⁰. Portanto, testamos nosso protocolo em A. baumannii 17978. Inicialmente, o procedimento foi inadequado. No entanto, modificamos a concentração de sacarose da solução de densidade média e melhoramos muito a separação(Figura 2). Um ensaio de nadh desidrogenase e um procedimento de extração e detecção de LOS/LPS foram utilizados para confirmar a separação para A. baumannii, tipo selvagem S. Tipilásurio e dois genótipos enterobacterianos deficientes de oantígeno; ou seja, gale-mutante S. Typhimurium e uma cepa de laboratório, E. coli DH5α (Figura 3 e Figura 4).

A intenção deste trabalho é fornecer uma abordagem simplificada para isolar reprodutivelmente as membranas das bactérias Gram-negativas. O protocolo pode ser usado para estudar muitos tipos de moléculas associadas à membrana para esses micróbios.