Taramalı Elektron Mikroskobu için Embriyo, Yumurta Kabuğu ve Mantar Kültürünün İşlenmesi

Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ultrastrüktürel analizi ve hücre içi görüntüleme prokaryotların, bitkilerin ve hayvanların üç boyutlu profilini çıkarmak için ışık mikroskobunu tamamlar. Bir SEM’nin yüksek uzamsal çözünürlüğü, onu nanometreden mikrometre ölçeğine kadar numunelerin mikroyapısal özelliklerinin incelenmesi için mevcut olan en çok yönlü ve güçlü tekniklerden biri haline getirir. Kurutulmuş numuneler, fonksiyonel ilişkiler hakkında geçerli sonuçlar geliştirmenin temelini oluşturan, yoğun ayrıntılarla kompozisyon ve topografik yapılara çözülür^{1,2,3 , 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9}– Biyolojik örneklerin SEM görüntüleri yorumlarken, doğal yapılar ve işleme sırasında oluşturulan eserler arasında ayrım yapmak büyük bir meydan okumadır. SEM genellikle örnek^10,11yayılan birincil, ikincil veya geri dağınık elektron ışınları etkileyen gaz molekülleri herhangi bir girişim önlemek için çok yüksek vakumlar çalıştırılır. Ayrıca, biyolojik maddeler kötü veya iletken olmayan özellikleri nedeniyle radyasyon hasarına duyarlıdır. Sem’e yüklenen numunelerin tamamen kuru ve organik kirletici maddelerden arındırılmış olması ve yüksek vakum ortamında gazgiderme olasılığına karşı 10^,11. Biyolojik numuneler çoğunlukla sudan oluştuğu için, yerli yapıların korunmasını sağlamak için ek preparatif teknikler gereklidir.

Elde edilen çözünürlük, numune tiplerine ve kullanılan enstrümental parametrelere özgü hazırlama yöntemlerinin optimize edilmesine dayanmaktadır. Bu nedenle, tüm doku tipleri için genelleştirilmiş işleme adımları kullanmaktan kaçınmak gerekir. Bazı biyolojik numuneler yapılarını korumak için daha az sıkı işleme gerektirirken, büzülme ve çökme gibi kurutma eserlerinin piyasaya sürülmesini önlemek için hassas numune türleri için daha fazla zaman ve bakım gerekebilir. Örnek hazırlama SEM görüntülemede kritik bir adımdır; morfometrik çalışmaların bulguları örnek hazırlama prosedürleri^12,13tarafından belirgin bir şekilde etkilenmiştir. Birçok biyolojik numune için ortak hazırlık adımları, yüzeylerini SEM analizi için iletken olarak dönüştürmek için altın, platin veya paladyum gibi bir metalle fiksasyon, dehidratasyon ve kaplamadır. Kullanılan adımların niteliği ve kombinasyonu dokunun türüne ve çalışmanın özel hedeflerine bağlı olarak değişir. Şarj birikmesi, vakum ve elektron ışını hasarına duyarlılık yumuşak hassas biyolojik numuneleri işlerken sorun teşkil ederek nesnenin doğal yapısını korumak için ek işleme adımları gerektirir. Osmiyum tetroksit sabitleme gibi konvansiyonel yöntemler kullanarak, ve dehidratasyon büzülme ve hassas dokuların çöküşüneden^14,15,16,17. Çalışmanın amacı, yumuşak hassas dokuları (örneğin, sürüngen embriyoları, boyalı kaplumbağaların yumurta kabuğu ve mantar kültürleri) hazırlamak ve imajlandırmak için yapılan değişikliklerle önceki çalışmalardan elde edilen fikirleri birleştirerek elde edilen zarif metodolojiler oluşturmaktır.

Uygun bir sabitleme yönteminin seçilmesi biyolojik örneklerin mikroskobik analizi için ilk önemli adımdır. Bir organizmadan izole sonra hemen dokuların düzeltilmesi çürümeye bağlı morfolojilerinde değişimi önlemek için gereklidir. Etkili bir fiksatif, hücreleri hızlı bir şekilde etkileyerek ve numunenin yapısını stabilize etmek için etkisini geri dönülmez bir şekilde koruyarak hücresel süreçleri sona erdirmeli ve hem sonraki işlem adımlarına hem de SEM¹⁷ altında incelemeye dayanmalıdır. ^{, 18}. Çeşitli kimyasal ve fiziksel fiksasyon yöntemleri bilinmesine rağmen, kimyasal fiksasyon daha yaygın biyolojik örnekler için otoliz, putrefaction ve kurutma etkileri nedeniyle herhangi bir hücresel değişiklikleri önlemek için kullanılır. Literatürde tartışılan çok sayıda fiksatif kimyasal formülasyonlar vardır^17,19,20,21,^22,23, denaturing tarafından çalışmak fiksatifler ve biyolojik makromoleküllerin pıhtılaşma, ve kovalent çapraz-bağlantı makromoleküller tarafından düzeltmek olanlar. Alkoller ultrayapıyı çok kötü koruyan ve çoğunlukla ışık mikroskobu için kullanılan ve elektron mikroskobik analizi için tavsiye edilmeyen denaturing fiksatifler olarak kullanılır. Formaldehit, glutaraldehit ve osmium tetroksit gibi çapraz bağlantı fiksatifler dokular içindeki makromoleküller arasında moleküler ve intramoleküler çapraz bağlantı oluşturarak ultra yapıların mükemmel korunmasını sağlar^{11 ,24,25,26}. Biyolojik numuneler sıcaklığa duyarlıdır. Fiksasyon başında sıcaklık membran proteinlerinin yanal hareketliliğini azaltmak için 4 °C olması tavsiye edilir, hücreler arası moleküllerin difüzyonunu yavaşlatmak için, ve fiksasyon hızını yavaşlatmak için¹¹. Dokuların düzeltilmesi için gereken süre büyük ölçüde numunenin boyutuna ve fiksatif in numunenin bileşenleriyle birlikte yayıldığı ve tepki verdiği hıza bağlıdır. 4 °C’de PBS’de %4 paraformaldehit veya %3 glutaraldehit de bir gecede fiksasyon, bu çalışmada kullanılan örneklerin sıralı penetratif özellikleri açısından SEM analizi nde tercih edilen yöntemdir ve daha küçük hassas numunelerin işlenmesine olanak sağlar^{17 , 18.000 , 19.09.20 , 20.000 , 27}– Osmiyum tetroksit ile bir fiksasyon sonrası adım sadece toksik doğası nedeniyle ortadan kaldırılır ama aynı zamanda bu çalışmada analiz örnekleri için görüntü kalitesini artırmak için hiçbir ek avantaj uygulamak bulundu.

Biyolojik numuneler SEM işlemini engelleyen sıvılar içerir; bu nedenle, örneklerin SEM numune odasına yerleştirilmeden önce kurutulması gerekir. Dehidratasyon sağlandıktan sonra, yüzey gerilimi/kuruma nedeniyle numunelere objeler oluşturulmadan çözücü dokudan uzaklaştırılmalıdır. Üç farklı kurutma yöntemleri yaygın SEM görüntüleme için dokuların işlenmesi sırasında kullanılmıştır: hava kurutma, kritik nokta kurutma, ve dondurma kurutma örnekleri^28,29,30,31. Birkaç çalışma hayvan dokusu örnekleri^28,29,30,31ile aynı sonuçları üreten üç kurutma yöntemleri rapor. Daha küçük numuneler için kullanılan genel bir uygulama alkol ve hexamethyldisilazane konsantrasyon serisi artan kimyasal dehidratasyon vardır (HMDS), ancak daha büyük örnekler kritik bir nokta kurutma kullanılarak kurutulur (CPD) alet³². Kurutma işlemi sırasında, numuneden sıvı/gaz arabirimi ile geçen küçük boşluklarda oluşan önemli kuvvetler; bu bile içi boş yapıların tam bir çöküşüne yol açabilir³³. Tedavi nedeniyle meydana gelen herhangi bir deformasyon daha sonra numunenin doğal yapısal bir özelliği olarak yanlış olabilir. Bu nedenle, işleme için genelleştirilmiş fenomen ortadan kaldırılmalı ve özellikle hassas doku örnekleri analiz edildiğinde her doku tipi için benzersiz bir kurutma işlemi standartlaştırılmalıdır.

Yukarıda bahsedilen tüm süreçlerin çeşitli kombinasyonu kullanılarak yapılan çeşitli çalışmalarda, üç hassas dokuların SEM analizi için kullanılabilecek yöntemleri standartlaştırdık: sürüngen embriyoları, boyalı kaplumbağaların yumurta kabukları ve mantar kültürleri. Gelişimbiyologları ve morfolojistler temsili omurgalı hayvanlarda embriyo gelişimi sırasında normal ve anormal morfogenezi tanımlarlar. Gen sinyal yolları üzerinde yapılan araştırmalar yeni yapıların morfolojik tanımına bağlıdır. SEM analizi sırasında omurgalı embriyo yapısında ani bir değişiklik olmasını önlemek için, dehidratasyon sonrası kimyasal kuruma öneririz. HMDS kullanarak kimyasal kurutma nispeten yeni kurutma yöntemi dir ve avantajları göreceli çabukluk, kullanım kolaylığı, kayıp maliyet ve sınırlı uzmanlık ve ekipman⁹gerekli içerir. CPD, numuneler arasında belirli bir sıcaklık ve basınçta paslama CO₂ kullanılarak yaygın olarak kullanılan bir kurutma tekniğidir. HMDS’nin yumuşak hassas dokuların kurutulması için uygun olduğunu ve embriyonik dokularda kapsamlı deformasyona neden olan kritik nokta kurumasına göre daha büyük numunelerin işlenmesine olanak sağladığını belirledik. Mantarların morfolojik özelliklerini incelemek için SEM görüntüleme için örnekler hazırlamak için çeşitli yöntemler kullanılmıştır³⁴. Mantar örnekleri genellikle osmiyum tetroksit etanol dehidratasyon ve kritik nokta kurutma takip sabittir, hangi tatmin edici sonuçlar sağlayabilir,osmiyum tetroksit toksik etkileri 6 rağmen^,7,35 ve işleme sırasında çözelti değiştirirken mantar malzemelerini kaybetme dezavantajları belirgindir. Fiksasyon olmadan hava kurutma tekniği de uygulanmıştır^36, ancak küçülmüş ve çökmüş yapılarla sonuçlanmıştır ve bu tür örneklerin gözlemi, türleri karakterize ederken kolayca yanlış yorumlanabilir. Mantar hypha sıvılar ile temas bütünlüğünü kaybeder ve hatta kurutma yapısı geri elde olmayabilir. Bu etki nedeniyle, donma-kurutma genellikle mantar misel gibi yumuşak dokuların kurutma için kullanılır. Dondurma kurutma temiz malzemeler için iyi çalışır ancak herhangi bir tuz veya salgı varlığı sadece SEM görüntüleme aşamasında tespit edilecek yüzey detay belirsiz olacaktır. Biz bozulmamış mantar hyphae ve sporların yapısal detayları verim için glutaraldehit sabitleme ve kritik nokta kurutma ile slayt kültür yöntemi birleştiğinde. CPD kurutma embriyolarda büzülme neden olmasına rağmen, glutaraldehit fiksasyonu ile birleştiğinde iyi korunmuş misel yapıları sonuçlandı. Yumurta kabuğu sadece koruyucu bir kaplama olarak hareket değil, aynı zamanda mekanik istikrar, gaz ve su geçirgenliği ve gelişmekte olan embriyo için bir kalsiyum rezervi sağlayarak oviparous hayvanların embriyo için birincil önemtaşımaktadır. Tatlı su kaplumbağası yumurta kabukları kendi yapısına göre “sert” olarak sınıflandırılır veonların durumu nedeniyle biyologlar 1,^2,3,4 önemli ilgi almış ^{, 5.000 , 6.000 , 7.000 , 37.000 , 38′}e kadar.

Biz herhangi bir sert yumurta kabuğu türlerine uygulanabilir boyalı kaplumbağa yumurta kabuğu ve kabuk membranlar kolay incelenmesi için basit yöntemler detay. Hazırlık metodolojileri, ortaya çıkan görüntü kalitesi ve azaltılmış potansiyel eserlere göre değerlendirildi.