Summary

Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Published: August 16, 2019
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Summary

Hier stellen wir detaillierte Verarbeitungsprotokolle für die Abbildung empfindlicher Gewebeproben mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) vor. Drei verschiedene Verarbeitungsmethoden, nämlich Hexamethyl disilazana (HMDS) chemische Trocknung, einfache Lufttrocknung und kritische Punkttrocknung werden für die Herstellung von starren Eierschalen, Embryonen in frühen Entwicklungsstadien und Pilzkulturen beschrieben.

Abstract

Obwohl die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) häufig für die ultrastrukturelle Analyse verschiedener biologischer und nichtbiologischer Proben eingesetzt wird, sind Methoden, die an der Verarbeitung verschiedener biologischer Proben beteiligt sind, mit einzigartigen Praktiken verbunden. Alle in der Literatur beschriebenen konventionellen Verfahren zur Verarbeitung von Proben finden immer noch nützliche Anwendungen, aber subtile Änderungen in der Probenvorbereitung können die Bildqualität verändern und Artefakte einführen. Daher ist die Verwendung einer einzigartigen Probenvorbereitungstechnik, die speziell auf die Art des analysierten Gewebes zugeschnitten ist, erforderlich, um ein qualitativ hochwertiges Bild mit ultrastruktureller Auflösung zu erhalten. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der Bereitstellung optimaler Probenvorbereitungsprotokolle für bildgebende Embryonen, starre Eierschalen und Pilzkulturen mit SEM. Die folgenden Optimierungen wurden empfohlen, um gute Ergebnisse für die drei verschiedenen untersuchten empfindlichen biologischen Proben zu erzielen. Die Verwendung von milderen Fixativen wie 4% Paraformaldehyd oder 3% Glutaraldehyd gefolgt von Dehydrierung mit Ethanol-Serie ist obligatorisch. Pilzmyzel auf Agarblöcken, die durch Gleitkulturen gewonnen werden, ergibt eine bessere ultrastrukturelle Integrität im Vergleich zu Kulturen, die direkt aus Agarplatten stammen. Die chemische Trocknung von Embryonen mit HMDS sorgt für das Trocknen ohne Oberflächenspannung im Vergleich zur kritischen Punkttrocknung. HMDS verhindert Risse durch Schrumpfung, da Proben beim Trocknen weniger spröde sind. Für die Pilzkultur bietet die kritische Punkttrocknung jedoch eine akzeptable Bildqualität im Vergleich zur chemischen Trocknung. Eierschalen können ohne spezielle Vorbereitungsschritte mit Ausnahme einer gründlichen Waschung und Lufttrocknung vor der Montage abgebildet werden. Die Vorbereitungsmethoden wurden auf der Grundlage einer akzeptablen Bildqualität standardisiert, die bei jeder Studie ermittelt wurde.

Introduction

Rasterelektronenmikroskop (SEM) Ultrastrukturanalyse und intrazelluläre Bildgebung ergänzen die Lichtmikroskopie zur dreidimensionalen Profilierung von Prokaryoten, Pflanzen und Tieren. Die hohe räumliche Auflösung eines SEM macht es zu einer der vielseitigsten und leistungsstärksten Techniken, die für die Untersuchung mikrostruktureller Eigenschaften von Proben im Nanometer-Mikrometer-Skala zur Verfügung stehen. Ausgetrocknete Exemplare werden zu kompositorischen und topographischen Strukturen mit intensiven Details aufgelöst, was die Grundlage für die Entwicklung gültiger Schlussfolgerungen über funktionelle Beziehungen1,2,3 bildet. , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.Bei der Interpretation von SEM-Bildern biologischer Proben ist es eine große Herausforderung, zwischen einheimischen Strukturen und den Artefakten zu unterscheiden, die während der Verarbeitung entstehen. SEM wird in der Regel mit sehr hohen Vakuums betrieben, um Interferenzen durch Gasmoleküle zu vermeiden, die die primären, sekundären oder zurückgestreuten Elektronenstrahlen der Probe10,11beeinflussen. Außerdem sind biologische Materialien aufgrund ihrer schlechten oder nicht leitenden Eigenschaften anfällig für Strahlungsschäden. Es ist wichtig, dass die in das SEM geladenen Proben vollständig trocken und frei von organischen Verunreinigungen sind, um mögliche Ausgasungen in einer Hochvakuumumgebung zu vermeiden10,11. Da biologische Proben meist aus Wasser bestehen, sind zusätzliche Präparative Techniken erforderlich, um sicherzustellen, dass die einheimischen Strukturen erhalten bleiben.

Die erhaltene Auflösung basiert auf der Optimierung von Vorbereitungsmethoden, die für Probentypen und verwendete Instrumentparameter spezifisch sind. Daher ist es notwendig, die Verwendung von generalisierten Verarbeitungsschritten für alle Gewebetypen zu vermeiden. Einige biologische Proben benötigen eine weniger strenge Verarbeitung, um ihre Struktur zu erhalten, während für empfindliche Probentypen möglicherweise mehr Zeit und Sorgfalt erforderlich sind, um das Einbringen von Trocknungsartefakten wie Schrumpfung und Kollaps zu vermeiden. Die Probenvorbereitung ist ein wichtiger Schritt in der SEM-Bildgebung; die Ergebnisse morphometrischer Studien werden durch Probenvorbereitungsverfahren12,13bemerkenswert beeinflusst. Häufige Vorbereitungsschritte für viele biologische Proben sind Fixierung, Dehydrierung und Beschichtung mit einem Metall wie Gold, Platin oder Palladium, um ihre Oberflächen leitfähig für die SEM-Analyse umzuwandeln. Die Art und Kombination der verwendeten Schritte hängt von der Art des Gewebes und den spezifischen Zielen der Studie ab. Ladungsaufbau, Empfindlichkeit gegenüber Vakuum- und Elektronenstrahlschäden stellen Probleme bei der Verarbeitung weicher empfindlicher biologischer Proben dar, was zusätzliche Verarbeitungsschritte erforderlich macht, um die native Struktur des Objekts beizubehalten. Mit konventionellen Methoden wie Osmiumtetroxid-Fixierung, und Dehydrierung verursachen Schrumpfung und den Zusammenbruch von empfindlichen Geweben14,15,16,17. Ziel der Studie ist es, elegante Methoden zu etablieren, die durch die Kombination von Ideen aus früheren Studien mit Modifikationen zur Herstellung und Abbildung von weichen empfindlichen Geweben (z. B. Reptilienembryonen, Eierschalen von bemalten Schildkröten und Pilzkulturen) abgeleitet werden.

Die Auswahl eines geeigneten Befestigungsverfahrens ist der erste wichtigste Schritt für die mikroskopische Analyse biologischer Proben. Die Fixierung des Gewebes unmittelbar nach der Isolierung von einem Organismus ist wichtig, um Veränderungen in ihrer Morphologie durch Zersetzung zu verhindern. Ein wirksames Fixierungsmittel sollte zelluläre Prozesse beenden, indem es die Zellen schnell durchdringt und die Wirkung irreversibel beibehält, um die Struktur der Probe zu stabilisieren, um sowohl nachfolgenden Verarbeitungsschritten als auch einer Untersuchung unter dem SEM17 standzuhalten. , 18. Obwohl mehrere chemische und physikalische Fixierungsmethoden bekannt sind, wird chemische Fixierung häufiger für biologische Proben verwendet, um zelluläre Veränderungen aufgrund von Autolyse-, Verwesungs- und Trocknungseffekten zu vermeiden. Es gibt zahlreiche fixative chemische Formulierungen in der Literatur diskutiert17,19,20,21,22,23, Fixative, die durch Denaturierung und koagierende biologische Makromoleküle und solche, die durch kovalent vernetzung von Makromolekülen fixieren. Alkohole werden als denaturierende Fixative verwendet, die die Ultrastruktur sehr schlecht erhalten und hauptsächlich für die Lichtmikroskopie verwendet werden und nicht für elektronenmikroskopische Analysen empfohlen werden. Vernetzung von Fixativen wie Formaldehyd, Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid erzeugen eine intermolekulare und intramolekulare Vernetzung zwischen Makromolekülen innerhalb des Gewebes und bieten eine hervorragende Konservierung von Ultrastrukturen11 ,24,25,26. Biologische Proben sind temperaturempfindlich. Die Temperatur zu Beginn der Fixierung wird empfohlen, 4 °C zu sein, um die laterale Mobilität von Membranproteinen zu reduzieren, die Diffusion interzellulärer Moleküle zu verlangsamen und die Fixierungsrate zu verlangsamen11. Die für die Behebung des Gewebes benötigte Zeit hängt weitgehend von der Größe der Probe und der Geschwindigkeit ab, mit der das Fixierungsmittel mit den Komponenten der Probe diffundiert und reagiert. Eine nächtliche Fixierung in 4% Paraformaldehyd oder 3% Glutaraldehyd in PBS bei 4 °C ist die bevorzugte Methode für die SEM-Analyse von Proben, die in dieser Studie für ihre sequenziellen penetrativen Eigenschaften verwendet werden, die die Verarbeitung kleinerer empfindlicher Proben ermöglichen17 , 18 , 19 , 20 , 27. Ein Post-Fixierungsschritt mit Osmiumtetroxid wird nicht nur aufgrund seiner toxischen Natur eliminiert, sondern auch festgestellt, dass er keinen zusätzlichen Vorteil zur Verbesserung der Bildqualität für die in dieser Studie analysierten Proben implementiert.

Biologische Proben enthalten Flüssigkeiten, die den SEM-Betrieb stören; Daher müssen die Proben getrocknet werden, bevor sie in die SEM-Probenkammer eingesetzt werden. Sobald die Austrocknung gewährleistet ist, muss das Lösungsmittel aus dem Gewebe entfernt werden, ohne aufgrund der Oberflächenspannung/-trocknung Artefakte in die Proben zu erzeugen. Drei verschiedene Trocknungsmethoden wurden häufig bei der Verarbeitung von Geweben für die SEM-Bildgebung verwendet: Lufttrocknung, kritische Punkttrocknung und Gefriertrocknungsproben28,29,30,31. Wenige Studien berichten von allen drei Trocknungsmethoden, die identische Ergebnisse mit tierischen Gewebeproben28,29,30,31ergeben. Eine allgemeine Praxis, die für kleinere Proben verwendet wird, ist die chemische Dehydrierung durch aufsteigende Konzentrationsreihen von Alkohol und Hexamethyldisilazan (HMDS), aber größere Proben werden mit einem kritischen Punkttrocknungsgerät (CPD)32getrocknet. Während des Trocknungsprozesses bilden sich erhebliche Kräfte in kleinen Hohlräumen, die durch eine Flüssigkeits-/Gasschnittstelle durch die Probe geleitet werden; dies kann sogar zu einem vollständigen Zusammenbruch der Hohlkonstruktionenführen 33. Jede Verformung, die durch die Behandlung auftritt, könnte dann als natives strukturelles Merkmal der Probe verwechselt werden. So sollte das generalisierte Phänomen für die Verarbeitung eliminiert und ein einzigartiger Trocknungsprozess für jeden Gewebetyp standardisiert werden, insbesondere wenn empfindliche Gewebeproben analysiert werden.

In mehreren Versuchen, die mit verschiedenen Kombinationen aller oben genannten Verfahren durchgeführt wurden, standardisierten wir die Methoden, die für die SEM-Analyse von drei empfindlichen Geweben verwendet werden können: Reptilienembryonen, Eierschalen von bemalten Schildkröten und Pilzkulturen. Entwicklungsbiologen und Morphologen beschreiben normale und abnorme Morphogenese während der Embryoentwicklung bei repräsentativen Wirbeltieren. Untersuchungen zu Gensignalwegen hängen von der morphologischen Beschreibung neuartiger Strukturen ab. Um eine abrupte Veränderung der Wirbeltier-Embryostruktur während der SEM-Analyse zu vermeiden, empfehlen wir eine chemische Trocknung nach Austrocknung. Chemische Trocknung mit HMDS ist die relativ neueste Trocknungsmethode und die Vorteile sind relative Schnelligkeit, Benutzerfreundlichkeit, Kostenverluste und das begrenzte Know-how und die benötigte Ausrüstung9. CPD ist eine häufig verwendete Trocknungstechnik, bei der CO2 bei einer bestimmten Temperatur und einem bestimmten Druck über die Proben hinweg gesteuert wird. Wir haben festgestellt, dass HMDS zum Trocknen von weichen empfindlichen Geweben geeignet ist und die Verarbeitung größerer Proben im Vergleich zur kritischen Punkttrocknung ermöglicht, die eine umfangreiche Verformung embryonaler Gewebe verursachte. Mehrere Methoden wurden verwendet, um Proben für SEM-Bildgebung vorzubereiten, um die morphologischen Eigenschaften von Pilzen zu untersuchen34. Pilzproben werden häufig in Osmiumtetroxid, gefolgt von Ethanoldehydrierung und kritischer Punkttrocknung, fixiert, was zufriedenstellende Ergebnisse liefern kann, obwohl die toxischen Wirkungen von Osmiumtetroxid6,7,35 und der Verlust von Pilzmaterialien beim Wechsel von Lösungen während der Verarbeitung sind ausgesprochene Nachteile. Die Probenvorbereitungstechnik mit Lufttrocknung ohne Fixierung wurde ebenfalls36 praktiziert, führt aber zu geschrumpften und zusammengebrochenen Strukturen, und die Beobachtung solcher Proben kann leicht falsch interpretiert werden, während die Art charakterisiert wird. Pilz-Hypha verliert seine Integrität in Kontakt mit Flüssigkeiten und eine gleichmäßige Trocknung kann nicht erreicht werden, um die Struktur wiederherzustellen. Aufgrund dieses Effekts wird die Gefriertrocknung häufig zum Trocknen von Weichgeweben wie Pilzmyzel verwendet. Gefriertrocknung funktioniert gut für saubere Materialien, aber das Vorhandensein von Salzen oder Sekretion wird Oberflächendetails verdecken, die nur auf der SEM-Betrachtungsphase identifiziert werden. Wir haben die Gleitkulturmethode mit Glutaraldehyd-Fixierung und kritischer Punkttrocknung gekoppelt, um strukturelle Details intakter Pilzhyphen und Sporen zu ergeben. Obwohl die CPD-Trocknung schrumpfe in Embryonen, führte sie in Verbindung mit der Glutaraldehyd-Fixierung zu gut erhaltenen myzelialen Strukturen. Die Eierschale ist von primärer Bedeutung für den Embryo von eiförmigen Tieren, da sie nicht nur als Schutzhülle fungiert, sondern auch mechanische Stabilität, Durchlässigkeit für Gas und Wasser und eine Kalziumreserve für den sich entwickelnden Embryo bietet. Süßwasserschildkröten-Eierschalen werden aufgrund ihrer Struktur als “starr” eingestuft und aufgrund ihrer Verfügbarkeit von Biologenmitgroßer Aufmerksamkeit 1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.

Wir beschreiben einfache Methoden zur einfachen Untersuchung von Eierschalen- und Schalenmembranen von lackierten Schildkröten, die auf jede starre Eierschalenart angewendet werden können. Die Methoden der Vorbereitung wurden anhand der resultierenden Bildqualität und reduzierten potenziellen Artefakten bewertet.

Protocol

HINWEIS: Bemalte Schildkröten -Chrysemys picta) Eier, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden während der Brutzeit von Mai bis Juni 2015-16 von der Rice Creek Field Station, Oswego New York mit Genehmigung des New York State Department of Environmental gesammelt Konservierung (DEC). 1. Chemische Trocknungsmethode zur Verarbeitung von Embryonen für SEM Sammeln Sie Schildkröteneier von Feldstandorten während der Brutzeit. Bereiten Sie die Inkubationskammern im Vorau…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt die rasterelektronenmikrografische Analyse von gemalten Schildkrötenembryonen (Chrysemys picta). Bemalte Schildkröteneier, die auf einem Einstreumedium gesammelt und inkubiert wurden, die nach der chemischen Trocknung auf Aluminiumstummeln montiert waren, wurden für die SEM-Bildgebung verwendet (Abbildung 1A-E). Eine seitliche Ansicht eines Embryos der Stufe 12 zeigt die craniofacial Strukturen; die Oberkieferpromi…

Discussion

In unserer Studie wurden verschiedene Fixierungsmittel, Dehydrierungs- und Trocknungsmethoden getestet, um drei verschiedene empfindliche biologische Proben für die SEM-Bildgebung vorzubereiten: Embryonen, Eierschalen und Pilzkulturen. SEM wird häufig für die Oberflächenanalyse verwendet, so dass die fixative Penetration weniger besorgniserregend ist, aber es muss verstanden werden, dass schlecht fixierte interne Strukturen nach innen schrumpfende oder/und kollabierte Oberflächenstrukturen verursachen. Erweiterte Fi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego für hilfreiche Diskussionen und Kommentare zum Manuskript. Diese Studie wurde von Rice Creek Associate Grants, Oswego, unterstützt; Challenge Grants SUNY Oswego and National Science Foundation (NSF) Small Grants to PGL and JG.

Materials

Agar Fischer Scientific S25127A for slide cultures
Aluminum pin stub Tedpella 16111 12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar BD 213400 DF0013-17-6 Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol Fischer BioReagents BP904-100 Antibiotic for media
Coarse Vermiculite Greenhouse Megastore SO-VER-12 bedding medium
Clear 12- well plate Corning 07-201-589 for fixing embryo
Coverslips Fischer Scientific S17525B for slide culture
Critical Point Dryer Quorum CPD EMS850 critical point drying
Culture dishes Fischer Scientific 08 747B DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol Fischer Scientific A406P 4 dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers Tedpella 5804 style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde Fischer Scientific G151-1 fixative
Gold target for sputter coater DENTON VACUUM TAR001-0158 Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana Fischer Scientific C19479-5000 chemical drying agent
Kim wipes Kimtech S-8115 cleaning
Microscope slides Thermo Scientific 67-762-16 for slide culture
Microscopy Scissors Tedpella 1327 Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors Tedpella 1346 Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon Fine Science Tools 10370-17 Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts Corning 0330B09 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde Fischer Scientific T353 500 fixative
Peat moss Walmart- Miracle Gro 551705263 bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape Tedpella 5000 12 mm OD
Sputter coater DENTON VACUUM DESK V thin metal coating
SEM JEOL USA JEOL JSM 6610LV scanning electron scope electron microscopy

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Citer Cet Article
Gibbons, J., Geetha-Loganathan, P. Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (150), e60018, doi:10.3791/60018 (2019).

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