Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor
Summary
Um ensaio ex vivo da fatia permite que o conseqüência do nervo oculomotor seja imaged no tempo real. As fatias são geradas incorporando E 10.5 ISLMN: embriões de GFP no agarose, cortando em um vibratome, e crescendo em uma incubadora do estágio-parte superior. O papel das vias de orientação do AXON é avaliado pela adição de inibidores aos meios de cultura.
Abstract
Os movimentos de olho exatos são cruciais para a visão, mas o desenvolvimento do sistema do motor da ocular, especial as vias moleculars que controlam a orientação do AXON, não foi elucidado inteiramente. Isto é em parte devido às limitações técnicas de ensaios tradicionais da orientação do AXON. Para identificar indicações adicionais da orientação do AXON que influenciam o nervo oculomotor, um ensaio ex vivo da fatia à imagem o nervo oculomotor no tempo real enquanto cresce para o olho foi desenvolvido. E 10.5 ISLMN-os embriões de GFP são usados para gerar fatias ex vivo incorporando os no agarose, cortando em um vibratome, então crescendo os em uma incubadora do estágio-parte superior do microscópio com photomicroscopia do tempo-lapso para 24-72 h. fatias de controle recapitulam o tempo in vivo de crescimento de axônios do núcleo para a órbita. Os inibidores da molécula pequena ou as proteínas de recombinação podem ser adicionados aos meios de cultura para avaliar o papel de caminhos diferentes da orientação do AXON. Este método tem as vantagens de manter mais do microambiente local através do qual os axônios atravessam, não axotomizing os axônios crescentes, e avaliando os axônios em vários pontos ao longo de sua trajetória. Ele também pode identificar efeitos em subconjuntos específicos de axônios. Por exemplo, a inibição de CXCR4 provoca axônios ainda dentro do midbrain para crescer dorsalmente ao invés de ventralmente, mas axônios que já saíram ventralmente não são afetados.
Introduction
O sistema do motor da ocular fornece um sistema elegante para investigar mecanismos da orientação do AXON. É relativamente uncomplicated, consistindo em três nervos cranianos que inervam seis músculos extraocular (eoms) que movem o olho, e os da labii superioris do do levator (LPs) que levanta a pálpebra. O nervo oculomotor inerva os LPS e quatro EOMs-o oblíquo inferior e os músculos do músculo reto medial, inferior e superior. Os outros dois nervos, os troclear e os abducens, cada um somente inervam um músculo, o músculo oblíquo superior e lateral do reto, respectivamente. Os movimentos oculares proporcionam uma leitura fácil, mostrando se a inervação era apropriada, ausente ou aberrante. Adicionalmente, há uns distúrbios humanos do movimento do olho que resultam dos deficits no desenvolvimento neuronal ou na orientação do AXON, denominados coletivamente as desordens cranianas congênitas da disinervação (CCDDs)1.
Apesar destas vantagens, o sistema do motor da ocular é usado raramente em estudos2,3,4,5,6,7,8 da orientação do AXON, 9 anos de , 10, devido aos inconvenientes técnicos. Os ensaios de orientação de AXON in vitro têm muitas desvantagens11. Os ensaios da co-cultura, em que os explantes neuronal são cultivados junto com explantes do tecido do alvo12 ou as pilhas transfected13, dependem da simetria do explante e do posicionamento preciso entre o explante e o tecido do alvo. Ensaios de listra14,15, em que duas pistas são estabelecidas em listras alternadas e axônios são avaliados para o crescimento preferencial em uma listra, só indicam que um substrato é preferível ao outro, não que seja atraente ou repulsivo, ou fisiologicamente relevante. As câmaras de Microfluidics podem dar forma a Gradients químicos precisos, mas os axônios crescentes do assunto ao esforço de cisalhamento16,17,18, que podem afetar seu crescimento. Além disso, em cada uma dessas abordagens, a coleta de explantes ou células dissociadas requer que os axônios em crescimento sejam axotomizados e, portanto, esses ensaios realmente examinam a regeneração do AXON, em vez do crescimento inicial do AXON. Finalmente, essas abordagens in vitro removem o microambiente que influencia os axônios e suas respostas a pistas ao longo de diferentes pontos de seu curso, e tradicionalmente só testam uma sugestão isolada. Compondo estas desvantagens, o tamanho pequeno de cada núcleo no sistema do motor da ocular faz a dissecção que desafia tecnicamente para explantes ou culturas dissociada. Adicionalmente, as culturas preliminares de neurônios do motor da ocular são geralmente heterogêneas, têm a morte de pilha significativa, e são dependentes da densidade, exigindo o agrupamento das pilhas dos embriões múltiplos (Ryosuki Fujiki, uma comunicação pessoal). In vivo métodos, no entanto, incluindo modelos de mouse knockout, são inadequados para uso para triagem, dado o tempo e despesa necessária.
Métodos desenvolvidos para a cultura de embriões inteiros19 permitir a rotulagem de células migratórias20 ou bloqueio de moléculas específicas21, mas culturas embrionária inteiras exigem incubação em garrafas de rolos que impede a imagem em tempo real de rotulados Estruturas. Técnicas cirúrgicas que permitem a manipulação do embrião e, em seguida, subsequente desenvolvimento posterior quer no útero ou no abdômen da mãe (manutenção da conexão placentária)22 também são possíveis, mas estes também não permitem lapso de tempo Imaging.
Para superar os obstáculos de ensaios in vitro e permitir a rápida triagem de vias de sinalização, desenvolveu-se uma técnica de cultura de fatia embrionária ex vivo23, adaptada de um protocolo previamente publicado para o crescimento do nervo periférico24. Usando este protocolo, o nervo oculomotor de desenvolvimento pode ser imaged sobre o tempo na presença de muitas das estruturas circunvizinhas ao longo de sua trajetória, incluindo alvos de EOM. Ao adicionar inibidores de pequenas moléculas, fatores de crescimento ou indicações de orientação aos meios de cultura, podemos avaliar perturbações de orientação em vários pontos ao longo da trajetória do AXON, permitindo uma avaliação mais rápida dos potenciais fatores de crescimento e orientação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo ex vivo da cultura da fatia fornece vantagens significativas sobre os ensaios tradicionais da orientação do AXON23. O tamanho de cada núcleo do motor craniano não é um fator limitante, e nenhuma dissecção difícil é necessária. O microambiente endógeno através do qual os axônios viajam são mantidos, permitindo a modificação de uma via de sinalização, mantendo outras vias de sinalização. Adicionalmente, os efeitos podem ser avaliados em diferentes pontos ao longo d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento fornecido pelo National Eye Institute [5K08EY027850], Instituto Nacional de saúde da criança e desenvolvimento [U54HD090255], Harvard-Vision programa de desenvolvimento clínico cientista [5K12EY016335], os Cavaleiros Templários Eye Foundation [carreira Starter Grant], e a Children ‘ s Hospital ophthalmology Foundation [faculdade Discovery Award]. ECE é um investigador do Instituto médico Howard Hughes.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
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