Summary

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

Published: July 16, 2019
doi:

Summary

Un test etta ex vivo permette di immaginare l’escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 IslMN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.

Abstract

Movimenti accurati degli occhi sono cruciali per la visione, ma lo sviluppo del sistema motorio oculare, in particolare le vie molecolari che controllano la guida degli assi, non è stato completamente chiarito. Ciò è in parte dovuto ai limiti tecnici dei tradizionali saggi di orientamento degli assoni. Per identificare ulteriori segnali di guida ascia che influenzano il nervo oculomotore, è stato sviluppato un saggio ex vivo per immaginare il nervo oculomotore in tempo reale man mano che cresce verso l’occhio. Gli embrioni E10.5 IslMN-GFP vengono utilizzati per generare fette ex vivo incorporandole in agarose, tagliandole su un vibratoma, per poi coltivarle in un’incubatrice a stadio al microscopio con fotomicroscopia time-lapse per 24-72 h. Le fette di controllo riassumono il ricapitolare il tempismo in vivo della crescita degli assoni dal nucleo all’orbita. Gli inibitori delle piccole molecole o le proteine ricombinanti possono essere aggiunti ai mezzi di coltura per valutare il ruolo dei diversi percorsi di guida degli assoni. Questo metodo ha i vantaggi di mantenere più del microambiente locale attraverso il quale gli assoni attraversano, non assiomizzando gli assoni in crescita e valutando gli assoni in più punti lungo la loro traiettoria. Può anche identificare gli effetti su specifici sottoinsiemi di assoni. Ad esempio, l’inibizione di CXCR4 fa sì che gli assoni ancora all’interno del midbrain crescano dorsalmente piuttosto che ventralmente, ma gli assoni che sono già usciti dal ventralsi non sono interessati.

Introduction

Il sistema motore oculare fornisce un elegante sistema per studiare i meccanismi di guida degli assoni. È relativamente semplice, costituito da tre nervi cranici che innervadono sei muscoli extraoculari (EOM) che muovono l’occhio, e la superiorità levatore palpebra (LPS) che solleva la palpebra. Il nervo oculomotore innerva l’LPS e quattro EOM – i muscoli obliqui inferiori e mediali, inferiori e superiori. Gli altri due nervi, il trochlear e l’abducens, ognuno solo innervare un muscolo, il superiore obliquo e muscolo di retto laterale, rispettivamente. I movimenti oculari forniscono una facile lettura, mostrando se l’innervazione era appropriata, mancante o aberranti. Inoltre, ci sono disturbi del movimento dell’occhio umano che derivano da deficit nello sviluppo neuronale o guida assone, collettivamente chiamato i disturbi didisinnervazione cranica congeniti (CCDD)1.

Nonostante questi vantaggi, il sistema motorio oculare è raramente utilizzato negli studi di guida degli assoni2,3,4,5,6,7,8, 9 (in vie , 10, a causa di inconvenienti tecnici. I saggi di guida assoni in vitro hanno molti svantaggi11. I saggi di co-coltura, in cui gli espiante neuronali vengono coltivati insieme agli espianti del tessuto bersaglio12 o delle cellule trasfette13, dipendono sia dalla simmetria dell’espianto che dal posizionamento preciso tra l’espianto e il tessuto bersaglio. I saggi Striscia14,15, in cui due spunti sono disposti a strisce alternate e gli assoni sono valutati per la crescita preferenziale su una striscia, indicano solo che un substrato è preferibile all’altro, non che uno dei due sia attraente o ripugnante, o fisiologicamente rilevante. Le camere microfluidiche possono formare precisi gradienti chimici, ma soggetti a picconi in crescita per inclinare lo stress di taglio16,17,18, che possono influenzare la loro crescita. Inoltre, in ciascuno di questi approcci, la raccolta di espianti o cellule dissociate richiede che gli assoni in crescita in crescita siano assitopi e quindi questi saggi esaminino effettivamente la rigenerazione degli assoni, piuttosto che la crescita iniziale degli assoni. Infine, questi approcci in vitro rimuovono il microambiente che influenza gli assoni e le loro risposte ai segnali lungo diversi punti del loro corso, e tradizionalmente testano solo un segnale in isolamento. A complicare questi svantaggi, le piccole dimensioni di ogni nucleo nel sistema motorio oculare rendono la dissezione tecnicamente difficile per gli espianti o per le colture dissociate. Inoltre, le colture primarie di motoneuroni oculari sono di solito eterogenee, hanno una morte cellulare significativa e dipendono dalla densità, richiedendo il raggruppamento di cellule da embrioni multipli (Ryosuki Fujiki, comunicazione personale). I metodi in vivo, tuttavia, compresi i modelli di topo a foratura, sono inappropriati da utilizzare per lo screening, dati i tempi e le spese richiesti.

Metodi sviluppati per la coltura di embrioni interi19 consentono l’etichettatura delle cellule migratorie20 o il blocco di molecole specifiche21, ma le colture intere embrionali richiedono incubazione in bottiglie a rulli che preclude l’imaging in tempo reale di etichettato Strutture. Sono possibili anche tecniche chirurgiche che consentono la manipolazione dell’embrione e il successivo ulteriore sviluppo sia nell’utero che nell’addome della madre (mantenendo la connessione placentare)22, ma anche queste non consentono il time-lapse Imaging.

Per superare gli ostacoli dei saggi in vitro e consentire uno screening rapido dei percorsi di segnalazione, è stata sviluppata una tecnica di coltura a fette embrionale ex vivo23, adattata da un protocollo precedentemente pubblicato per la escrescenza del nervo periferico24. Utilizzando questo protocollo, il nervo oculomotore in via di sviluppo può essere immaginato nel tempo in presenza di molte delle strutture circostanti lungo la sua traiettoria, compresi gli obiettivi dell’oOM. Aggiungendo inibitori di piccole molecole, fattori di crescita o indicazioni guida ai media di coltura, possiamo valutare le perturbazioni di orientamento in più punti lungo la traiettoria dell’assone, consentendo una valutazione più rapida dei potenziali fattori di crescita e di guida.

Protocol

Tutto il lavoro sugli animali qui descritto è stato approvato ed eseguito in conformità con i protocolli del Boston Children’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Accoppiamenti a tempo Posizionare ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP)1Slp/J Stock No: 017952) topi maschi e femmine insieme durante la notte. Pesare le femmine e registrare i pesi prima d…

Representative Results

Risultati normali: la figura 1 fornisce uno schema dell’esperimento. A partire dall’E9.5 nel topo, i primi assoni cominciano ad emergere dal nucleo oculomotore26. Con E10.5, un nervo oculomotore a fasciculato, che contiene i primi neuroni pionieri, può essere visto nel mesenchyme. C’è una significativa variabilità tra gli embrioni a E10.5 (anche all’interno della stessa lettiera) in quanto il nervo è progredito verso l’orbita, probabilmente a causa delle differenz…

Discussion

Questo protocollo di coltura delle fette ex vivo offre vantaggi significativi rispetto alle tradizionali indicazioni degli assoni23. La dimensione di ogni nucleo motorio cranico non è un fattore limitante, e non è necessaria alcuna dissezione difficile. Il microambiente endogeno attraverso il quale gli assoni viaggiano, consentendo la modifica di un percorso di segnalazione pur mantenendo altri percorsi di segnalazione. Inoltre, gli effetti possono essere valutati in punti diversi lungo la traie…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finanziamenti forniti dal National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], la Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], e la Children’s Hospital Ophthalmology Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE è un investigatore dell’Howard Hughes Medical Institute.

Materials

24-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-107
6-Well Tissue Culture Plate Genesee Scientific 25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) VWR 14672-200
Fine Forceps Fine Science Tools 11412-11
Fluorobrite DMEM Thermo Fisher Scientific A1896701
Glucose (200 g/L) Thermo Fisher Scientific A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550H
HEPES Buffer Solution (1M) Thermo Fisher Scientific 15630106
L-Glutamine (250 nM) Thermo Fisher Scientific 25030081
Loctite Superglue Loctite
Low Melting Point Agarose Thermo Fisher Scientific 16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) Millipore Sigma PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 
Petri Dish (100 x 15mm) Genesee Scientific 32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) Thermo Fisher Scientific 10010049
Razor Blades VWR 55411-050
Surgical Scissors – Blunt Fine Science Tools 14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF Nikon
Vibratome (VT 1200S) Leica 1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) Ted Pella, Inc. 121-6

References

  1. Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
  2. Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
  3. Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
  4. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
  5. Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
  6. Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
  7. Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Biologie du développement. 399 (1), 68-79 (2015).
  8. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
  9. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
  10. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
  11. Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
  12. Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
  13. Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
  14. Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
  15. Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
  17. Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
  18. Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
  19. Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Biologie du développement. 244 (1), 155-169 (2002).
  20. Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
  21. Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
  22. Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
  23. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
  24. Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
  25. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
  26. Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
  27. Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
  28. Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
  29. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).

Play Video

Citer Cet Article
Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (149), e59911, doi:10.3791/59911 (2019).

View Video