Summary

In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

Published: July 29, 2019
doi:

Summary

L’imaging ottico transcranico consente l’imaging ad ampio campo del trasporto di fluidi cerebrospinali nella corteccia di topi vivi attraverso un cranio intatto.

Abstract

Il flusso del liquido cerebrospinale (CSF) nei roditori è stato ampiamente studiato utilizzando la quantificazione ex vivo dei traccianti. Tecniche come la microscopia a due fotoni e la risonanza magnetica (MRI) hanno permesso la quantificazione in vivo del flusso CSF, ma sono limitate rispettivamente dalla riduzione dei volumi di imaging e dalla bassa risoluzione spaziale. Recenti lavori hanno scoperto che il CSF entra nel parenchyma cerebrale attraverso una rete di spazi perivascolari che circondano il pial e le arterie penetranti della corteccia dei roditori. Questa entrata pericolare di CSF è un fattore principale del sistema glimphatico, una via implicata nella clearance dei soluti metabolici tossici (ad es. amiloide-z). Qui, illustriamo una nuova tecnica di imaging macroscopico che permette l’imaging mesoscopico in tempo reale dei traccianti CSF fluorescenti attraverso il cranio intatto dei topi vivi. Questo metodo minimamente invasivo facilita una moltitudine di progetti sperimentali e consente test singoli o ripetuti delle dinamiche CSF. I Macroscopi hanno un’alta risoluzione spaziale e temporale e la loro grande distanza di gantry e lavoro consentono l’imaging durante l’esecuzione di attività sui dispositivi comportamentali. Questo approccio di imaging è stato convalidato utilizzando misurazioni di imaging a due fotoni e fluorescenza ottenute da questa tecnica fortemente correlate alla fluorescenza ex vivo e alla quantificazione dei traccianti con etichetta radio. In questo protocollo, descriviamo come l’imaging macroscopico transcranico può essere utilizzato per valutare il trasporto glimphatico nei topi vivi, offrendo un’alternativa accessibile a modalità di imaging più costose.

Introduction

Il liquido cerebrospinale (CSF) bagna il cervello e il midollo spinale ed è coinvolto nel mantenimento dell’omeostasi, nella fornitura di nutrienti e nella regolazione della pressione intracranica1. CSF nello spazio subaracnoideo entra nel cervello attraverso una rete di spazi perivascolari (PVS) che circondano le arterie corticali piali e poi scorre lungo arteriole penetranti2. Una volta nel parenchyma, CSF si scambia con il fluido interstiziale (ISF), trasportando metaboliti nocivi come l’amiloide-z (A) e gli aggregati proteici tau fuori dal cervello attraverso tratti di materia bianca a bassa resistenza e spazi perivenous2,3 . Questa via dipende dai canali astrogliali di acquaporina-4 (AQP4) ed è stata quindi definita il sistema gliale-linfatico (glimphatico)4. I prodotti di scarto del neuropil vengono infine eliminati dal CSF-ISF attraverso vasi linfatici vicino ai nervi cranici e nelle meningi verso i linfonodi cervicali5. Il fallimento di questo sistema è stato implicato in diverse malattie neurologiche come il morbo di Alzheimer6,7, lesioni cerebrali traumatiche3, e ictus ischemico ed emorragico8.

Il trasporto CSF può essere visualizzato infondendo traccianti nella cisterna magna (CM)9,10 e studi glimphatici in passato hanno utilizzato principalmente la microscopia a due fotoni4,11,12, 13, risonanza magnetica (RM)14,15,16,17ed ex vivo imaging3,6,11, 18 per valutare la cinetica tracciante. La microscopia a due fotoni è un metodo adatto per l’imaging dettagliato dei traccianti CSF nei PVS e del parenchyma a causa della sua alta risoluzione spaziale, tuttavia, ha un campo visivo stretto e richiede una finestra cranica invasiva o un assottigliamento del cranio. L’imaging ex vivo, in combinazione con l’immunohistochimica, consente analisi multilivello che vanno da singole cellule fino all’intero cervello19. Tuttavia, il processo di perfusione-fissazione che è necessario per osservare il tessuto post-mortem produce profondi cambiamenti nella direzione del flusso CSF e collassa il PVS, alterando significativamente la distribuzione e la posizione dei traccianti12. Infine, mentre la risonanza magnetica può tracciare il flusso di CSF in tutto il murino e il cervello umano, manca di risoluzione spaziale e temporale del flusso perivascolare.

Una nuova tecnica, l’imaging macroscopico transcranico, risolve alcuni di questi limiti consentendo l’imaging ad ampio campo del trasporto di CSF perivascolare nell’intera corteccia dorsale dei topi viventi. Questo tipo di imaging viene eseguito con un macroscopio epifluorescente utilizzando un cubo di filtro multibanda, una sorgente luminosa a LED regolabile e una fotocamera CMOS ad alta efficienza10. Questi set-up sono in grado di risolvere PVS fino a 1-2 mm sotto la superficie del cranio e in grado di rilevare fluorofori fino a 5-6 mm sotto la superficie corticale, lasciando il cranio completamente intatto10. Filtri multibanda e LED in grado di ottimizzare rapidamente la lunghezza d’onda dell’eccitazione consentono l’uso di più fluorofori che consentono alla CSF di essere etichettati con traccianti di diversi pesi molecolari e proprietà chimiche nello stesso esperimento.

Questa procedura richiede un intervento chirurgico semplice e minimamente invasivo per esporre il cranio e posizionare una piastra della testa leggera per stabilizzare la testa durante la sessione di imaging. I traccianti possono essere consegnati nel CM senza perforare nel cranio o penetrare nel tessuto corticale con pipette o cannulas9,20. Sia le cannule CM che le piastre della testa rimangono stabili da diversi giorni a settimane e facilitano progetti sperimentali più complessi rispetto alla classica visualizzazione del punto finale. Questo protocollo descrive come l’imaging macroscopico transcranico viene utilizzato per studiare la funzione del sistema glimphatico a seguito di iniezione acuta o cronica di tracciante CSF fluorescente nel CM di topi anestetizzati/dormienti o svegli.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato universitario per le risorse animali (UCAR, Protocollo n. 2011-023) presso l’Università di Rochester ed eseguiti secondo la Guida NIH per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. 1. Preparazione della cisterna magna cannula, della piastra di testa e del supporto della testa Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e le piastre della testa prima dell’intervento chirurgico.NOTA: I traccianti fluorescenti vengono conse…

Representative Results

L’afflusso di CSF è rappresentato su un macroscopio epifluorescente (Figura 1A), che consente l’imaging mesoscopico del trasporto tracciante CSF nella corteccia murina. La piastra della testa integrale permette la visualizzazione delle ossa nasali rostrali, sia ossa frontali che parietali al centro, e la porzione rostrale dell’osso interparietale caudally (Figura 1B). Durante l’imaging, le suture nasofrontale, sagittale, coronale e lambdoid possono essere facil…

Discussion

Abbiamo descritto un protocollo dettagliato per l’esecuzione di imaging TRANScranico CSF in topi vivi utilizzando macroscopi fluorescenti e traccianti fluorescenti disponibili in commercio. Questa tecnica è semplice e minimamente invasiva, ma quantitativa. L’imaging in vivo è ben correlato con metodi sensibili come il conteggio della scintillazione liquida di traccianti con etichetta radio, tra cui 3H-dextran e 14C-inulin dopo la consegna CM, e con la quantificazione della sezione coronale ex vivo…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke e dal National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 e RF1AG057575 a MN), il programma Fondation Leducq Transatlantic Networks of Excellence e il programma di ricerca e innovazione EU Horizon 2020 (n. 666881; SVDs-target). Ringraziamo anche Dan Xue per l’assistenza di esperti con illustrazioni grafiche.

Materials

0.25% Bupivacaine HCl University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock Hamilton Company 81020
A-M Systems Dental Cement Powder Fisher Scientific NC9991371
Carprofen University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine Prevantics B10800
CMOS Camera Hammamatsu ORCA Flash 4.0
Head Plate University of Rochester No catalog # Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery Bovie Medical Corporation AA01
Insta-set Accelerator Bob Smith Industries BSI-151
Isoflurane – Fluriso Vet One 502017 University of Rochester Vivarium
Ketamine Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue Elmer's Products, Inc No catalog #, see link in comments https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape Fisher Scientific 19-027-761
Paraformaldehyde Sigma-aldrich P6148
PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous Braintree Scientific PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe Harvard Apparatus 70-4501
PURALUBE VET OINTMENT Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks Fisher Scientific 22-029-553
Research Macro Zoom Microscope Olympus MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice) Narishige International USA Inc MAG-1
Single-use Needles, BD Medical VWR BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 22-363-750
Tunable LED PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine University of Rochester Vivarium

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Citer Cet Article
Sweeney, A. M., Plá, V., Du, T., Liu, G., Sun, Q., Peng, S., Plog, B. A., Kress, B. T., Wang, X., Mestre, H., Nedergaard, M. In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy. J. Vis. Exp. (149), e59774, doi:10.3791/59774 (2019).

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