Фреймворк «Эвовер» обеспечивает высокопропускную непрерывную микробную культуру с высоким разрешением и динамическим контролем над экспериментальными параметрами. Этот протокол демонстрирует, как применять систему для проведения сложного фитнес-эксперимента, направляя пользователей на программирование автоматизированного контроля над многими отдельными культурами, измеряя, собирая и взаимодействуя с экспериментальными данными в режиме реального времени.
Непрерывные методы культуры позволяют клеткам выращиваемых в количественно контролируемых экологических условиях, и, таким образом, широко полезны для измерения фенотипов фитнеса и улучшения нашего понимания того, как генотипы формируются путем выделения. Обширные недавние усилия, направленные на разработку и применение нишевых устройств непрерывной культуры, выявили преимущества проведения новых форм контроля за культурой клеток. Это включает в себя определение пользовательского давления отбора и увеличения пропускной способности для исследований, начиная от долгосрочных экспериментальных эволюции генома широкий выбор библиотеки и синтетической схемы гена характеристика. Платформа Эволюционивер была недавно разработана для удовлетворения растущего спроса: непрерывная платформа культуры с высокой степенью масштабируемости, гибкости и автоматизации. Эвовер обеспечивает единый стандартизацию платформы, которая может быть (пере)-настроен и масштабируется с минимальными усилиями для выполнения многих различных типов высокой пропускной способностью или многомерных экспериментов отбора роста. Здесь представлен протокол для предоставления пользователям фреймворка Эвовер описание для настройки системы для проведения пользовательского, крупномасштабный непрерывный эксперимент роста. В частности, протокол направляет пользователей о том, как запрограммировать систему на мультиплексный два выбора давления-температура и осмоллярность-через многие флаконы Эвовер для того, чтобы количественно фитнес-пейзажи сахаромицеты сервициэ мутанты в порядке Разрешение. Мы показываем, как устройство может быть настроено как программно, через его с открытым исходным кодом веб-программное обеспечение, и физически, путем организации fluiудической и аппаратной макеты. Процесс физически настройке устройства, программирование культуры рутины, мониторинг и взаимодействующих с экспериментом в режиме реального времени через Интернет, выборки флаконов для последующего автономного анализа, и после эксперимента анализа данных являются подробными. Это должно послужить отправной точкой для исследователей различных дисциплин, чтобы применить Эвовер в разработке своих собственных сложных и высокопроизводительных экспериментов по росту клеток для изучения и манипулирования биологическими системами.
Непрерывные методы культуры клетки, сперва превращили почти 70 лет тому назад1,2, наслаждаются недавним возрождением3,4. Это связано с стечением факторов. Во-первых, развитие методов высокой пропускной способности, которые сделали возможным зачтение и создание большого числа генотипов5,6, создало сопутствующий спрос на экспериментальные методики, облегчающие Хорошо контролируемый рост клеток и фенотипирование. С этой целью непрерывная культура представляет собой мощный экспериментальный подход, чтобы извлечь выгоду из возникающих достижений геномной. Содействуя росту/экспериментам над клеточными популяциями в точно контролируемых (и динамичных) условиях окружающей среды, непрерывная культура предоставляет средства для строгого сопоставления генотипов к фенотипам7,8, количественно охарактеризовать инженерии штаммов и организмов9, и отслеживать адаптивные генетические изменения в лабораторных исследований эволюции10,11,12.
Во-вторых, недавнее появление методов доступного прототипирования, таких как аддитивное производство и элементы аппаратного и программного обеспечения с открытым исходным кодом, позволило более широкому кругу пользователей разрабатывать и создавать свои собственные рентабельные формы непрерывных систем культуры непосредственно в лаборатории. Все это привело к захватывающим массив сделай сам (DIY) устройства, которые выполняют непрерывную функциональность культуры, такие как ххимиотерастат13, turbidostat14, или морбидостат15. К сожалению, хотя успех в решении конкретных (нишевых) проблем, для которых они были разработаны, эти специальные решения, как правило, не имеют возможности масштабировать в пропускной способности и/или экспериментальной конструкции сложности.
Система Эвовер была разработана с целью создания единой платформы, которая может вместить растущие экспериментальные потребности непрерывной культуры и соответствовать скорости и масштабу возникающих геномных методов16 (рис. 1a). Дизайн эволюционирует реализует общие принципы, лежащие в основе высоко масштабируемые технологии из других дисциплин17, в том числе стандартизированные следы, модульные компоненты, и с открытым исходным кодом принципы проектирования. Таким образом, решения для новых нишевых приложений могут быть спроектированы без серьезных изменений в системе. Состоит из высоко модульных и с открытым исходным кодом, оборудование, электроника, и веб-программное обеспечение, Эволюционивер является первой автоматизированной непрерывной системы культуры, которые могут быть экономически эффективно и легко повторно настроен на проведение практически любого типа эксперимент по росту высокой пропускной способности. Благодаря модульным и программируемым смарт-рукавам, в которых находятся все датчики и приводы, необходимые для управления отдельными культурами, Эволвер однозначно обеспечивает масштабирование как пропускной способности, так и индивидуального контроля условий культуры. Кроме того, как веб-платформа, Эвовер обменивается данными и информацией с удаленными компьютерами в режиме реального времени, позволяя одновременному мониторингу сотен отдельных культур и автоматизированной культуры возмущений через произвольно определенный контроль Алгоритмы.
В предыдущей работе16, надежные показатели Эволвер был продемонстрирован в долгосрочных экспериментах в течение сотен часов работы, и его способность культивировать различные организмы, от E. coli и с . цервиии для неодомашненных Микробов. Была проведена серия различных экспериментов по отбору, в которых программно определены многомерные градиенты отбора были применены по всему спектру индивидуальных условий культуры и в результате этого клеточные фитнес-ландшафты были Количественно. Здесь цель состоит в том, чтобы предоставить пользователям Эвовер описание того, как использовать систему для проектирования и этих типов экспериментов. В качестве иллюстративного примера, методы количественного фитнес-пейзаж с. сервициэ мутантов через двумерный экологический градиент, состоящий из температуры и осмотического напряжения представлены. Протокол направляет пользователей через настройку платформы Эвовер для этого эксперимента как программно, в использовании программного обеспечения для установки заказной мутности и контроля температуры процедуры для каждой из 16 параллельных культур непрерывного, и физически, через макет флюидики надлежащим образом маршрут СМИ различной концентрации соли. Этот протокол должен служить в качестве общей рубрики для настройки Эволюционивер для выполнения широкого спектра автоматизированных непрерывных экспериментов культуры для различных исследований и дисциплин.
Выбор роста является незаменимым инструментом в биологии, широко используемый для создания и характеристики фенотипических различий между клеточной популяции. В то время как партии культур позволяют выбор роста ограниченным образом, непрерывные методы культуры резко расширяют степень контроля и предсказуемости этих экспериментов, оказывая точное регулирование по форме и динамике отбора, чтобы генерировать повторяемые количественные результаты22. Непрерывная культура используется для тщательного контроля отбора для библиотек высокого разнообразия20,23,24,25и для внедрения сложных адаптивных режимов в экспериментальных и направленная эволюция11,12,26,27. Непрерывная культура также позволяет точную характеристику клеток через массив количественно контролируемых условиях, чтобы лучше понять сложные генетические системы и оптимизировать инженерии штаммов биопроизводство9,14 , 28.
Однако, нет универсального протокола для непрерывной культуры, так как незначительные изменения в селективных условиях могут привести к резким изменениям биологических исходов4,29,30. Экспериментаторы должны уметь выбирать между режимами отбора и соответствующим образом адаптировать экспериментальные протоколы и оборудование. В дополнение к предложению выбора между параметрами управления, такие системы идеально будут достаточно сложными, чтобы самостоятельно управлять несколькими параметрами одновременно в высоко-параллельных экспериментах, которые необходимы для расшифровки взаимодействующих входов в сложных биологических систем (например, Эпистаз). Эволюционивер решает эту проблему, предоставляя пользователям возможность произвольно управлять обратной связью между условиями культуры и функциями флюидов для указания узкоспециализированных экологических ниш.
Чтобы преодолеть ограничения в текущей настройке и расширить или изменить параметры управления, смарт-рукав может быть легко изменен, чтобы добавить новые датчики или приводов. Дополнительно, уменьшая объем флакона уменьшал бы расходования средств, которые могут быть значительно в непрерывной культуре. В то время как текущий дизайн позволяет измерение и контроль температуры, агитация культуры, световой индукции, мутности, и флюидики, другие параметры должны быть измерены внешне путем отбора проб из флаконов. Текущая работа включает в себя способность контролировать ферментативную активность через люциферазы и регулировать растворенный кислород и pH непосредственно в культурах Эвовер. Кроме того, не будучи продемонстрирован в этой работе, Эвовер может взаимодействовать с новыми миллимузидической мультипикционными устройствами16 , которые рисуют на принципах крупномасштабной интеграции (происходящий из электроники и принятой микрофлюидией) для того, чтобы недорого включить более сложные флюидов обработки (например, мультиплексы флюидов входы, пузырек к флаконе переводы). Эти подарочные модули могут быть разработаны и изготовлены полностью в лаборатории, что позволяет пользователям маршрутных жидкостей программично приводя различные комбинации клапанов в автоматизированных fluiудических процедур. Это позволяет пользователям преодолевать жесткие флюидные конструкции, традиционно используемые в непрерывной культуре, а также масштабировать fluiудические возможности с высокой пропускной способностью с меньшим числом дорогостоящих элементов управления (например, периститетические насосы). Наконец, мы надеемся на включение автомасштабирования платформы, которая будет использовать эти миллифлюидики и DIY компонентов, преодоление ограничения ручного взаимодействия во время длительных и больших экспериментов, где выборки культур будет громоздким.
В дополнение к физическим модификациям платформы, веб-программное обеспечение открывает новые степени свободы, позволяя пользователям писать, редактировать и обмениваться пользовательскими скриптами эволюционирующих, генерируя полностью автоматизированные, основанные на обратной связи программы культуры (например, turbidostat). Пользователи могут программно развертки по параметру диапазоны в тонкие вариации на ту же схему отбора или подключить алгоритмы управления в новых комбинациях, чтобы указать любое количество сложных схем отбора. Кроме того, способность легко отслеживать культуры в режиме реального времени преобразует способ, в котором эксперименты проводятся. Мониторинг в режиме реального времени, пользователи могут 1) проверить согласованность между пробегов, критическая особенность для биопроизводство приложений и высокой пропускной способностью экспериментов, и 2) вмешиваться во время экспериментов, если это необходимо, чтобы устранить сложные штаммы, которые проявляют плохой рост или формирование биопленки, или диагностировать ошибки пользователей (например, загрязнение). Наконец, с несколькими потоками данных, собираемых и интерпретируется в режиме реального времени для каждой отдельной культуры, Эволюционивер генерирует высокую плотность данных, что может облегчить машинное обучение подходы для нового анализа вниз по течению.
Помимо продемонстрировали использует для пригодности характеристика, выбор библиотеки, и Лаборатория эволюции, мы рассматриваем ряд смежных областях, как созрели для реализации в Эвовер с интегрированной флюидики. эксперименты эвовера с образцами микробиома могли бы проанализировать стабильность сообщества в контролируемых средах31,32, исследовать состав микробиоты с помощью методов культуромики33, или динамично смешивать виды, чтобы Допросите экологическую динамику колонизации или вторжения34,35. Многочисленные методы непрерывной направленной эволюции биомолекул может быть легко реализована на устройстве, а26,36,37, значительно увеличивая доступность и пропускную способность этих систем. Способность оптимизировать условия выращивания, такие как состав СМИ, температура и деформаций в динамичной, высокой пропускной природы может помочь в оптимизации усилий для промышленного биомантуринга приложений9. Далее мы предусматриваем вертикально интегрирующую Эвовер с другими методами анализа, такими как микроскопия и поток цитометрии в замкнутом цикле моды, обеспечивая полностью автоматизированную систему для роста и анализа клеточных культур как в одиночной клетке, так и в популяции Уровней. Кроме того, с некоторыми аппаратными изменениями в смарт-рукав, таких как уплотнения судна и контроля содержания газа, Эволюционивер потенциально может быть адаптирована для поддержки роста более широкого диапазона типов клеток, таких как подвеска клеток млекопитающих. Также возможно поместить всю структуру в анаэробную камеру для анаэробной клеточной культуры. Заглядывая вперед, мы стремимся создать нашу программную основу в централизованную облачную инфраструктуру и считаем, что это позволит пользователям легко настраивать, анализировать и обмениваться своими данными удаленно без необходимости физически присутствовать в лаборатории. Функционирующая в качестве куратора данных, облачная инфраструктура также поддается крупномасштабным метаанализу во всех экспериментах. Мы предполагаем, что Эволюционивер и эти будущие достижения значительно расширят сферу возможных экспериментов по выбору роста, способствуя автоматизации и инновациям в непрерывной культуре.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим б. Стэффорд за помощь в проектировании системы и х. Халиля, а. Солтаничзаде, а. Сун, с. Пайк и а. Кавале за помощь в строительстве системы. Мы признаем, электроника дизайн фонда (ЭДФ), инженерно-технический продукт инновационный центр (EPIC), а программное обеспечение & применение инновационной лаборатории (парус) в институте Харири для вычислений в Бостонском университете за их услуги. Эта работа была поддержана НФ (MCB-1350949 to А.С.К.), и DARPA грантов HR0011-15-C-0091 и HR0011-18-2-0014 (до А.С.К.). А.С.К. также признает, финансирование из низ директор новый новатор награда (1DP2AI131083-01), DARPA молодой факультет премии (D16AP00142), и ННФ в области вычислительной техники (СРС-1522074).
5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
eVOLVER Unit | FynchBio | ||
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
Pipettes | Eppendorf | ||
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |