Formación de carbonato de calcio en presencia de aditivos biopoliméricos

La biomineralización es la formación de minerales en presencia de moléculas orgánicas, a menudo relacionadas con funciones funcionales y/o estructurales en organismos vivos. La biomineralización puede ser intracelular, como en la formaciónde magnetita dentro de las bacterias magnetotácticas 1, o extracelulares, como en la formación de carbonato de calcio en las espigas de erizo de mar², de hidroxiapatita que está relacionada con el colágeno en huesos³ y de esmalte que se asocia con amelogenina en los dientes⁴. La biomineralización es un proceso complejo que depende de muchos parámetros en el organismo vivo. Por lo tanto, para simplificar el sistema en estudio, es necesario evaluar el efecto de componentes separados en el proceso. En muchos casos, la biomineralización es inducida por la presencia de biopolímeros extracelulares. El propósito del método aquí presentado es el siguiente: (1) Formar cristales de carbonato de calcio en presencia de biopolímeros aislados in vitro, utilizando un método de difusión de vapor. (2) Estudiar el efecto de los biopolímeros en la morfología y estructura del carbonato de calcio.

Se utilizan tres métodos principales para precipitar el carbonato de calcio in vitro en presencia de aditivos orgánicos^5,6. El primer método, al que nos referiremos como método de solución, se basa en mezclar una sal soluble de calcio (por ejemplo, CaCl₂) con una sal soluble de carbonato (por ejemplo, carbonato sódico). El proceso de mezcla se puede realizar de varias maneras: dentro de un reactor con tres células separadas por membranas porosas⁷. Aquí, cada una de las células externas contiene una sal soluble y la célula central contiene una solución con el aditivo que se va a probar. Calcio y carbonato difuso desde el exterior hasta la célula media, lo que resulta en la precipitación del carbonato de calcio menos soluble cuando las concentraciones de calcio y carbonato exceden su producto de solubilidad, K_sp á [Ca²⁺][CO₃ ^2-]. Un método de mezcla adicionales el procedimiento de doble chorro 8. En este método, cada sal soluble se inyecta de una jeringa separada a una solución agitada que contiene el aditivo, donde se precipita el carbonato de calcio. Aquí, la inyección y por lo tanto la velocidad de mezcla está bien controlada, en contraste con el método anterior donde la mezcla se controla por difusión.

El segundo método utilizado para cristalizar CaCO₃ es el método Kitano^9. Este método se basa en el equilibrio de carbonato/hidrógeno (2HCO₃^– _(aq) + Ca²⁺_(aq) CaCO 3_(s) + CO 2_(g) + H₂O _(l)). Aquí, el CO2 se burbujea en una solución que contiene CaCO₃ en una forma sólida, desplazando el equilibrio a la izquierda y por lo tanto disolviendo el carbonato de calcio. El carbonato de calcio no disuelto se filtra y los aditivos deseados se añaden a la solución rica en bicarbonato. A continuación, se permite que el CO2 se evapore, desplazando así la reacción a la derecha, formando carbonato de calcio en presencia de los aditivos.

El tercer método de cristalización de carbonato de calcio, que describiremos aquí, es el método de difusión de vapor¹⁰. En esta configuración, el aditivo orgánico, disuelto en una solución de cloruro de calcio, se coloca en una cámara cerrada cerca del carbonato de amonio en forma de polvo. Cuando el polvo de carbonato de amonio se descompone en dióxido de carbono y amoníaco, se difunden en la solución que contiene iones de calcio (por ejemplo, CaCl₂) y se precipita el carbonato de calcio (véase la figura 1 para la ilustración). Los cristales de carbonato de calcio pueden crecer por precipitación lenta o por precipitación rápida. Para la precipitación lenta, una solución que contiene el aditivo en la solución CaCl₂ se coloca en un desecador junto al polvo de carbonato de amonio. En la precipitación rápida, descrita en longitud en el protocolo, tanto la solución aditiva como el carbonato de amonio se colocan más cerca en una placa de varios pocillos. El método de precipitación lenta producirá menos centros de nucleación y cristales más grandes, y la precipitación rápida resultará en más centros de nucleación y cristales más pequeños.

Los métodos descritos anteriormente difieren en su complejidad técnica, en el nivel de control y en la velocidad del proceso de precipitación. El método de mezcla requiere una configuración especial⁶ tanto para el doble chorro como para el sistema de tres celdas. En el método de mezcla, la presencia de otros iones de contador solubles (por ejemplo, Na⁺, Cl^–)⁶ es inevitable, mientras que en el método Kitano, calcio y (bi) carbonato son los únicos iones en solución y no implica la presencia de contraiones (por ejemplo, Na⁺, Cl^–). Además, el método de mezcla requiere volúmenes relativamente grandes y por lo tanto no es adecuado para trabajar con biopolímeros caros. La ventaja del doble chorro es que es posible controlar la velocidad de inyección de la solución y que es un proceso rápido en comparación con otros métodos.

La ventaja del método Kitano y el método de difusión de vapor es que la formación de carbonato de calcio se controla mediante la difusión de CO₂ hacia/fuera de una solución CaCl_2, lo que permite sondear procesos de nucleación y precipitación más lentos ^{11 , 12}. Además, la formación de carbonato de calcio por difusión de CO2 puede parecerse a los procesos de calcificación in vivo^13,14,15. En este método, se forman cristales bien definidos y separados¹⁶. Por último, se puede probar el efecto de uno o varios biopolímeros en la formación de carbonato de calcio. Esto permite un estudio sistemático del efecto de una serie de concentraciones aditivas en la formación de carbonato de calcio, así como un estudio de mezclas de biopolímeros – todos realizados de manera controlada. Este método es adecuado para su uso con una amplia gama de concentraciones y volúmenes de aditivos. El volumen mínimo utilizado es de aproximadamente 50 l y, por lo tanto, este método es ventajoso cuando hay una cantidad limitada de los biopolímeros disponibles. El volumen máximo depende de la accesibilidad de una placa de pozo más grande, o del desecador en el que se va a insertar la placa o vaso de precipitados que contiene CaCl_2. El método descrito a continuación ha sido optimizado para trabajar en una placa de 96 pocillos con un biopolímero elegido para ser la proteína TapA^17.