生体高分子添加剤の存在下における炭酸カルシウム形成
Summary
生体高分子の存在下で形成される炭酸カルシウム結晶の沈殿および特性形成のためのプロトコルについて述べた。
Abstract
バイオミネラリゼーションは、有機分子の存在下での鉱物の形成であり、多くの場合、生物の機能的および/または構造的役割に関連する。これは複雑なプロセスであり、したがって、単純なインビトロ、システムは、バイオミネラリゼーションプロセスに対する単離分子の影響を理解するために必要とされます。多くの場合、バイオミネラリゼーションは細胞外マトリックス中の生体高分子によって導けられる。単離された生体高分子がインビトロでのカルサイトの形態および構造に及ぼす影響を評価するために、炭酸カルシウムの沈殿、電子顕微鏡検査、マイクロラマンの沈殿に対する蒸気拡散法を用いて特性評価を行い、結晶中の生体高分子の量を測定するための紫外線可視(UV/Vis)吸光度。この方法では、単離された生体高分子を塩化カルシウム溶液に溶解し、固体炭酸アンモニウムの分解に起因する気体アンモニアおよび二酸化炭素に暴露する。炭酸カルシウムの溶解性積に達した条件下で、炭酸カルシウム沈殿物や結晶が形成されます。炭酸カルシウムは、熱力学的安定性が異なる異なる多形を有する:非晶質炭酸カルシウム、バセライト、アラゴネート、およびカルサイト。バイオポリマーが存在しない場合、クリーンな条件下では、炭酸カルシウムは、炭酸カルシウムの最も熱力学的に安定した多形であるカルサイト形態に主に存在する。この方法は、炭酸カルシウム結晶の形態および構造に対する生体高分子添加剤の影響を調べる。ここでは、細胞外細菌タンパク質TapAの研究を通じて、炭酸カルシウム結晶の形成に関するプロトコルを実証する。具体的には、実験設定と、光学顕微鏡や電子顕微鏡、ラマン分光法などの特性解析方法に焦点を当てています。
Introduction
バイオミネラリゼーションは、有機分子の存在下での鉱物の形成であり、多くの場合、生物の機能的および/または構造的役割に関連する。バイオミネラリゼーションは、磁気細菌1内のマグネタイトの形成のように細胞内であってもよいが、細胞外、ウニスパイク2における炭酸カルシウムの形成のように、コラーゲンに関連するヒドロキシアパタイトの骨3と歯4のアメロゲニンに関連するエナメル質の.バイオミネラリゼーションは、生物の多くのパラメータに依存する複雑なプロセスです。したがって、検討中のシステムを簡素化するためには、工程に対する別個の成分の影響を評価する必要がある。多くの場合、バイオミネラリゼーションは細胞外生体高分子の存在によって誘導される。ここで提示される方法の目的は、(1)インビトロで単離された生体高分子の存在下で炭酸カルシウム結晶を形成し、蒸気拡散法を用いる。(2)生体高分子が炭酸カルシウムの形態及び構造に及ぼす影響を研究する。
有機添加物の存在下でインビトロで炭酸カルシウムを沈殿させる3つの主要な方法が5,6を使用する。我々が溶液法として言及する最初の方法は、カルシウムの可溶性塩(例えば、CaCl2)と炭酸の可溶性塩(例えば、炭酸ナトリウム)を混合することに基づいている。混合プロセスは、いくつかの方法で行われてもよい:多孔質膜7によって分離された3つの細胞を有する反応器内。ここで、各外部細胞は可溶性塩を含み、中央細胞は試験対象の添加剤を含む溶液を含有する。カルシウムと炭酸塩が外側から中間細胞に拡散し、カルシウムと炭酸塩の濃度が溶解性を超えると可溶性の低い炭酸カルシウムの沈殿が生じ、K sp= [Ca 2+][CO3]2-]。追加の混合方法は、二重ジェット手順8である。この方法では、各可溶性塩を別々の注射器から添加剤を含む攪拌溶液に注入し、そこで炭酸カルシウムが沈殿する。ここで、注射およびしたがって混合速度は、混合が拡散によって制御される前の方法とは対照的に、よく制御される。
CaCO3を結晶化するために使用される第2の方法は、キタノ法9である。 この方法は、炭酸塩/水素炭酸塩平衡(2HCO3– (aq)+Ca2+(aq)CaCO 
3(s)+CO2(g)+H2O(l))に基づいている。 ここで、CO2を固体形態でCaCO3を含む溶液に泡立て、平衡を左にシフトさせ、炭酸カルシウムを溶解させる。未溶解炭酸カルシウムを濾過し、所望の添加剤を重炭酸塩豊富な溶液に添加します。CO2は次いで蒸発させ、それによって反応を右にシフトさせ、添加剤の存在下で炭酸カルシウムを形成する。
ここで説明する炭酸カルシウム結晶化の第3の方法は、蒸気拡散法10である。このセットアップでは、有機添加剤は、塩化カルシウムの溶液に溶解し、粉末状の炭酸アンモニウム近くの密閉室に配置される。炭酸アンモニウム粉末が二酸化炭素とアンモニアに分解すると、カルシウムイオンを含む溶液に拡散し(例えば、CaCl2)、炭酸カルシウムが析出します(図1参照)。 炭酸カルシウム結晶は、低速沈殿または速い沈殿によって成長することができます。低速沈殿のために、CaCl2溶液中の添加剤を含む溶液を炭酸アンモニウム粉末の隣のデシケータに入れます。プロトコルで長さに記載されている速い沈殿において、添加液と炭酸アンモニウムの両方がマルチウェルプレートに近づけられます。低速の降水法は、より少ない核生成中心とより大きな結晶を生成し、速い沈殿は、より多くの核生成中心と小さな結晶をもたらすでしょう。
上記の方法は、その技術的な複雑さ、制御レベル、および降水プロセスの速度で異なります。混合方法は、ダブルジェットと3セルシステムの両方に特別なセットアップ6を必要とします。混合方法では、他の可溶性カウンターイオン(例えば、Na +、Cl-)6の存在は避けられませんが、キタノ法では、カルシウムおよび(bi)炭酸塩は溶液中の唯一のイオンであり、追加の存在を伴いません。カウンターイオン(例えば、Na+、Cl-)。さらに、混合方法は比較的大量を必要とするため、高価なバイオポリマーの作業には適していません。ダブルジェットの利点は、溶液注入速度を制御することができ、他の方法と比較して迅速なプロセスであることです。
キタノ法と蒸気拡散法の利点は、炭酸カルシウムの形成がCaCl2溶液の中へのCO2の拡散によって制御されるため、より遅い核生成および沈殿プロセスをプローブできることです。11歳,12.さらに、CO2の拡散による炭酸カルシウム形成は、生体内13、14、15における石灰化プロセスに類似してもよい。この方法では、明確に定義された分離された結晶が16に形成される。最後に、炭酸カルシウム形成に対する単一または複数の生体高分子の効果を試験することができる。これにより、炭酸カルシウム形成に対する一連の添加剤濃度の効果の系統的研究と、バイオポリマーの混合物の研究が可能になります。この方法は、添加剤の濃度と量の広い範囲での使用に適しています。使用される最小容積はおよそ50 μLであるため、この方法は利用可能な生体高分子の限られた量がある場合に有利である。最大容積は、より大きなウェルプレートのアクセシビリティ、またはCaCl2を含むプレートまたはビーカーを挿入するデシケータに依存します。以下に説明する方法は、タンパク質TapA17として選択された生体高分子を有する96ウェルプレートで働くために最適化されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、有機添加物の存在下で炭酸カルシウム結晶を形成し、インビトロで炭酸カルシウム結晶の形態および構造に対する有機生体高分子の影響を評価することを目的としている。この方法は、有機添加物の存在下で形成された結晶と対照実験で形成された石灰質結晶との比較に基づいている。拡散法を用いて炭酸カルシウム結晶を形成する方法、光学顕微鏡と電子顕微鏡を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、リア・アダディ教授、ジョナサン・エレス教授、ヤエル・ポリティ博士に実りある議論をしてくださったことに感謝したいと思います。この研究は、イスラエル科学財団(ISF)、助成金1150/14によって支援されています。
Materials
| Acetic acid | Gadot | 64-19-7 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 506-87-6 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 10035-04-8 | |
| Ethanol Absolute | Gadot | 64-17-5 | |
| Micro-Raman | Renishaw | inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 90i model | |
| Nis elements Br software | Nikon | For microscope imaging | |
| Scanning Electron Microscope | ThermoFisher Scientific | FEI Sirion microscope | |
| Spectrophotometer | JASCO | V-670 model | |
| Sputter coater | Polaron | SC7640 model |
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