Summary

VirWaTest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água

Published: May 11, 2019
doi:

Summary

Aqui nós apresentamos VirWaTest, que é um método simples, disponível e portátil para a concentração e a deteção dos vírus das amostras da água no ponto do uso.

Abstract

Vírus excretados por seres humanos e animais podem contaminar fontes de água e representam um risco para a saúde humana quando esta água é usada para beber, irrigação de alimentos, lavagem, etc. O indicador clássico de bactérias fecais nem sempre verifica a presença de patógenos virais para que a detecção de patógenos virais e indicadores virais seja relevante para adotar medidas de mitigação de riscos, especialmente em cenários humanitários e em áreas onde as manifestações virais transmitidas pela água são freqüentes.

Atualmente, vários testes comerciais que permitem a quantificação de bactérias indicadoras fecais (FIB) estão disponíveis para testes no ponto de uso. No entanto, tais testes comerciais não estão disponíveis para a detecção de vírus. A detecção de vírus em amostras de água ambiental requer a concentração de vários litros em volumes menores. Além disso, uma vez concentrada, a detecção de vírus depende de métodos como extração de ácidos nucleicos e detecção molecular (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR]-ensaios baseados) dos genomas virais.

O método descrito aqui permite a concentração de vírus de amostras de água de 10 L, bem como a extração de ácidos nucleicos virais no ponto de uso, com equipamentos simples e portáteis. Isso permite o teste de amostras de água no ponto de uso para vários vírus e é útil em cenários humanitários, bem como em qualquer contexto onde um laboratório equipado não está disponível. Alternativamente, o método permite concentrar os vírus presentes em amostras de água e o transporte do concentrado para um laboratório à temperatura ambiente para posterior análise.

Introduction

Durante as primeiras fases de qualquer emergência humanitária, o acesso a fontes de água potável, saneamento e higiene são fundamentais para a sobrevivência dos afetados. Portanto, a monitorização da qualidade da água é uma prioridade para prevenir surtos de águas. É bem sabido que a água contaminada é freqüentemente a origem das doenças, mas muitas vezes é difícil determinar as fontes de surtos virais, como o vírus da hepatite E (HEV), mesmo com a disponibilidade de métodos laboratoriais convencionais. O controle da qualidade da água é baseado na quantificação de FIB1,2,3,4. No entanto, tem sido extensivamente documentado que não há correlação entre a ausência de FIB e a presença de patógenos transmitidos por água viral, como rotavírus (RoV), norovírus (NoV) ou HEV5,6. Assim, o uso dos critérios de qualidade da água baseados em FIB pode resultar em uma subestimação dos riscos associados à presença de patógenos virais transmitidas por águas. A vigilância de vírus indicativos, tais como adenovírus humanos (hadv), ou patógenos específicos seria útil na definição da exposição a patógenos virais e identificando a fonte potencial de infecção humana7,8, 9,10 e na validação da eficácia das medidas sanitárias11.

Até agora, a detecção de vírus nesses cenários dependia de pessoal qualificado e logística complexa. VirWaTest (virwatest.org) destina-se ao desenvolvimento de um método simples, acessível e portátil para a concentração e subsequente detecção de vírus de amostras de água no ponto de uso.

A concentração de vírus é baseada no princípio da floculação orgânica de amostras de água de 10 L, pelas quais os vírus são recuperados em volumes menores12,13. Os flocos são recolhidos e adicionados a um tampão que lise os vírus e impede que os ácidos nucleicos da degradação quando armazenados na temperatura ambiente por não mais de 2 semanas.

O método da extração do ácido nucleico é baseado no uso de partículas magnéticas a que os ácidos nucleicos começ adsorbed. Eles podem ser transferidos de um tampão de lavagem para outro e, finalmente, para o tampão de eluição usando uma pipeta magnética à qual as partículas se unem. As suspensões de ácidos nucleicos virais obtidas podem ser enviadas para um laboratório de referência, onde a detecção pode ser realizada usando métodos moleculares baseados em PCR. Para cada extração de ácido nucleico, duas quantidades diferentes são testadas para descartar a inibição enzimática originada pela amostra. Alternativamente, com a disponibilidade mínima do equipamento, os testes de PCR podem ser executados no ponto de uso. Todo o processo é projetado para ser realizado independentemente de uma fonte de alimentação (Figura 1).

Um ensaio quantitativo de PCR para detectar HAdV, excretado por humanos e encontrado em amostras de águas residuais em altas concentrações, foi adaptado para ser executado no ponto de uso. HAdV são usados como indicadores virais fecais humanos. Um PCR para a quantificação do bacteriófago de MS2 foi adaptado igualmente desde que MS2 é usado em VirWaTest como o controle do processo. O método pode ser personalizado para a detecção de qualquer vírus de interesse.

Após o desenvolvimento, o método VirWaTest tem sido aplicado pelos usuários em duas configurações diferentes na República da África Central (RCA) e no Equador, fornecendo feedback sobre a aplicação do protocolo em situações reais.

A nosso conhecimento, este é o primeiro procedimento que permite a concentração e a deteção dos vírus no ponto de uso, independente de toda a fonte de alimentação, equipamento grande, e condições de congelação/refrigerando. Recomenda-se a coleta de duas repetições de cada amostra de água, a fim de obter resultados robustos.

Protocol

1. preparação e embalagem Nota: os materiais/equipamentos a serem embalados estão listados na tabela 1. Use luvas para manusear os reagentes necessários para o controle do processo, os reagentes de concentração, os reagentes de extração de ácido nucleico e os reagentes de detecção. Use óculos protetores para manusear os reagentes necessários para a extração de ácido nucleico. Controle de processo Prepare a cultura de ações…

Representative Results

Desenvolvimento de método Este procedimento foi desenvolvido no laboratório de contaminantes de vírus de água e alimentos com a colaboração de GenIUL e Oxfam Intermón. Compreende de três etapas diferentes. A primeira, a concentração de partículas virais, é uma adaptação de um método de floculação de leite desnatado previamente descrito12,17</s…

Discussion

O método VirWaTest permite a concentração de vírus e extração de ácido nucleico de amostras de água no ponto de uso por usuários não experientes. É um protocolo acessível, rápido e simples. A concentração baseia-se no princípio da floculação orgânica utilizando leite desnatado, pelo qual o pH baixo e as condições de alta condutividade tornam as proteínas do leite desnatadas agregadas em flocos os vírus adsorver. Quando o sedimento do flocos, é fácil recolhê-los, fazendo o possível concentrar 10…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O VirWaTest foi um projeto de pesquisa financiado pelo programa de fundos de inovação humanitária (HIF) da ELHRA (aprimorando o aprendizado & pesquisa para assistência humanitária). Os autores reconhecem as equipes de WASH que gentilmente colaboraram neste estudo. A análise de amostras no Equador foi financiada pela Oxfam Ecuador e Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-mas é um companheiro da Serra-caçador na Universidade de Barcelona.

Materials

5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) Solis BioDyne 08-14-00001 Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions
8-Microtube Strips with Caps dD Biolab 840637 Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR
Aquagenx CBT E. coli Kit Aquagenx, LLC ECCBT10 10 Tests per Kit
Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer GenIUL 900011674 Includes 12V car power adapter
Bucket Support GenIUL 900011648 Aluminium support
Bucket, 10 L Cater4You 10LTR Polypropilene, Tamperproof, Clear color
Centrifuge Tube, 50 mL LabBox CTSP-E50-050 Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt
Citric Acid 1-Hydrate, 500 g PanReac AppliChem 1410181211 Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram
Clear PET Bottle LabBox FPET-500-088 Clear Color, PET, Cap Not Included
Difco Skim Milk, 500 g Becton Dickinson 232100 Dehydrated
DNA/RNA Shield, 250 mL Zymo Research R1100-250 DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL
Easy9 Pipette Controller LabBox EAS9-001-001 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder
Eppendorf Tube, 0.5 mL Eppendorf 0030121023 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mL Eppendorf 0030120094 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mL dD Biolab 999542 Polypropylene, Sterile, Graduated
Ethanol 96% V/V, 1 L Panreac AppliChem 361085-1611 For UV, IR  and HPLC
Laboratory Tweezers LabBox FORS-007-002 Thin, Curved End, L= 120 mm
Magnetic Stirrer GenIUL 900017000 Battery-powered
Marker dD Biolab 929203 Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware
Micro Rota-Rack for Microtubes dD Biolab 37782 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR Cycler Coyote Biosciences, China Mini-8 Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes
NucliSens Lysis Buffer Biomerieux 200292 Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature
Open Tip Serological Pipette, 10 mL Deltalab 900136N Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
PE Screw Cap PP28 LabBox TP28-004-020 For PET Bottles
pH Indicator Strip LabBox WSPH-001-001 Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack
Plastic Test Tube Quimikals 300913 Includes Cap
Polyethylene Pasteur Pipette LabBox PIPP-003-500 Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL Deltalab 409726 Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL Deltalab 409526G Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL
Powder Powder Detergent Regular Powder Soap for washing clothes
Power Cables for Magnetic Stirrer GenIUL 900011692 Connection between batteries and magnetic stirrers
QuickPick Magnetic Tool BioNobile 24001 Hand-held tool for magnetic particles
QuickPick Tips in Box BioNobile 24296 RNase-Free, Autoclaved, 96 Units
QuickPick XL gDNA Magnetic Particles BioNobile SN51100 3.2 mL
Sea Salts Sigma-Aldrich S9883-500G An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water
Silicone Tubing LabBox SILT-006-005 Roll of 5 Meters, Inner  ø x Outer  ø= 6 x 10 mm
Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% VWR Chemicals 28244295 Pellets, 1 Kg
Solar Rotary Platform SOL-EXPERT Group 70020 Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams
SOLIScript 1-step Probe Kit Solis BioDyne 08-57-00250 Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions
SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit BioTools 21.141-4197 Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).
SpinBar Octhaedral Stirring Magnet dD Biolab 045926 Pivot Ring, L x  ø = 38 x 8 mm, Blue
Tape-End Serological Pipette, 10 mL Deltalab PN10E1 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Tape-End Serological Pipette, 50 mL Deltalab 900043 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover BioTools 22001-4291 Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL
Water Molecular Biology Reagent, 1L Sigma-Aldrich W4502-1L Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered
Whirl-Pak Bag, 540 mL Deltalab 200361 Stable bottom
Zip Lock Plain Bag LabBox BZIP-080-100 Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm

References

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Citer Cet Article
Aguado, D., Fores, E., Guerrero-Latorre, L., Rusiñol, M., Martínez-Puchol, S., Codony, F., Girones, R., Bofill-Mas, S. VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples. J. Vis. Exp. (147), e59463, doi:10.3791/59463 (2019).

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