水サンプル中のウイルス検出のための利用ポイント方法VirWaTest
Summary
ここでは、使用時点での水サンプルからのウイルスの濃度と検出のためのシンプルで手頃な価格でポータブルな方法であるVirWaTestを紹介します。
Abstract
人間や動物によって排泄されるウイルスは、水源を汚染し、この水を飲み物、食品灌漑、洗濯などに使用すると、人間の健康に危険をもたらす可能性があります。古典的な大腿菌の指標は、常にウイルス病原体の存在をチェックしないので、ウイルス病原体とウイルス指標の検出は、特に人道的なシナリオや地域でリスク軽減の対策を採用するために関連しています水媒介ウイルスの発生が頻繁に発生する場所。
現在、フェカル指標細菌(FIB)の定量を可能にするいくつかの市販試験が、使用時点での試験に利用可能である。しかし、このような商用テストは、ウイルスの検出には利用できません。環境水サンプル中のウイルスの検出には、数リットルを少量に濃縮する必要があります。さらに、いったん濃縮されると、ウイルスの検出は、ウイルスゲノムの核酸抽出および分子検出(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]ベースのアッセイ)などの方法に依存する。
ここで説明する方法は、10L水サンプルからのウイルスの濃度、ならびに使用時点でのウイルス核酸の抽出を、シンプルで携帯可能な装置と可能にする。これにより、複数のウイルスの使用時点での水サンプルの検査が可能になり、人道的なシナリオや、設備の整った実験室が利用できない状況で役立ちます。あるいは、この方法は、水サンプルに存在するウイルスを濃縮し、さらに分析するために室温で実験室に濃縮物を輸送することを可能にする。
Introduction
人道的緊急事態の最初の段階では、被災者の生存のためには、清潔な水の供給、衛生、衛生へのアクセスが不可欠です。したがって、水質の監視は、水媒介性の発生を防ぐための優先事項です。汚染水が病気の原因になることはよく知られていますが、従来の実験法が利用できる場合でも、E型肝炎ウイルス(HEV)などのウイルス発生源を特定することは困難です。水質の制御は、FIB1、2、3、4の定量に基づいています。しかしながら、FIBの不在とロタウイルス(RoV)、ノロウイルス(NoV)、またはHEV5、6などのウイルス水媒介病原体の存在との間に相関関係がないことが広範囲に文書化されている。したがって、FIBに基づく水質基準を使用すると、水媒介性ウイルス病原体の存在に関連するリスクを過小評価する可能性があります。ヒトアデノウイルス(HAdV)、または特定の病原体などの指標ウイルスのサーベイランスは、ウイルス病原体への曝露を定義し、ヒト感染の潜在的な原因を特定するのに役立つだろう7,8, 9,10および衛生対策の有効性を検証する 11.
これまで、これらのシナリオでのウイルスの検出は、熟練したスタッフと複雑なロジスティクスに依存していました。VirWaTest(virwatest.org)は、使用時点で水サンプルからのウイルスの濃度およびその後の検出のためのシンプルで手頃な価格の、ポータブルな方法の開発を目的としています。
ウイルス濃度は、10L水サンプルの有機凝集の原理に基づいており、それによってウイルスは小さな体積12、13で回収される。フロッハを採取し、ウイルスを分解し、2週間以内に室温で保存すると核酸の劣化を防ぐバッファーに添加されます。
核酸抽出法は、核酸が吸着する磁性粒子の使用に基づいている。それらは、粒子が付着する磁気ピペットを使用して、ある洗浄バッファーから別の洗浄バッファーに移され、最後に溶出バッファーに移すことができます。得られたウイルス核酸懸濁液は、PCRに基づく分子法を用いて検出を行うことができる基準実験室に出荷することができる。各核酸抽出について、2つの異なる量が試料によって生じた酵素阻害を排除するために試験される。また、機器の可用性を最小限に抑えながら、使用時点で PCR テストを実行することもできます。プロセス全体は、電源装置とは無関係に実行するように設計されています (図1)。
ヒトによって排泄され、高濃度の排水サンプル中に見られるHAdVを検出する定量的なPCRアッセイは、使用時に実行されるように適合されている。HAdV は、ヒトの fecal ウイルスインジケーターとして使用されます。.MS2バクテリオファージの定量化のためのPCRは、MS2がプロセス制御としてVirWaTestで使用されているので、適応されています。この方法は、目的の任意のウイルスの検出のためにカスタマイズすることができます。
開発後、VirWaTestメソッドは、中央アフリカ共和国(RCA)とエクアドルの2つの異なる設定でユーザーによって適用され、実際の状況でプロトコルの適用に関するフィードバックを提供しています。
私たちの知るところによれば、これは、電源、大型機器、凍結/冷却条件に依存しない、使用時点でのウイルスの濃度と検出を可能にする最初の手順です。堅牢な結果を得るために、各水サンプルの2つの反復を収集することをお勧めします。
Protocol
Representative Results
Discussion
VirWaTest法は、経験のないユーザーが使用する時点で水試料からのウイルスおよび核酸抽出の濃度を可能にする。これは、手頃な価格、迅速かつシンプルなプロトコルです。濃度は、スキムミルクを使用した有機凝集の原理に基づいており、低pHおよび高導電性条件により、脱脂乳タンパク質がウイルスに凝集してウイルスが吸着するフロッホに凝集する。フロッキング堆積物の場合、それら?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VirWaTestは、ELHRA(人道支援のための学習と研究の強化)プログラム(人道支援のための学習と研究の強化)プログラムによって資金提供された研究プロジェクトです。著者らは、この研究に親切に協力したWASHチームを認めている。エクアドルのサンプルの分析は、オックスファム・エクアドルとディレクシオン・デ・インベチガシオネス・デ・ラ・ユニバーシダ・デ・ラス・アメリカス(AMB)によって資金提供されました。BRT.17.01) S.ボフィルマスは、バルセロナ大学のセラハンターの仲間です。
Materials
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Aquagenx CBT E. coli Kit | Aquagenx, LLC | ECCBT10 | 10 Tests per Kit |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | – | – | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. . The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).
- Bartram, J., et al. . Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).
- World Health Organization. . Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).
- World Health Organization. . 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water – The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. . ISO 10705-1:1995: Water quality – Detection and enumeration of bacteriophages – Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
