Summary

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

Published: July 10, 2019
doi:

Summary

Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.

Abstract

Um fator crucial na melhoria da eficácia da terapia celular para a regeneração miocárdica é de forma segura e eficiente aumentar a taxa de Engraftment celular. Y-27632 é um inibidor altamente potente da proteína quinase (RhoA/ROCK) associada a Rho, coiled-coil, e é usada para prevenir a apoptose celular induzida por dissociação (anoikis). Nós demonstramos que o pré-tratamento de Y-27632 para os cardiomiócitos pluripotentes induzidos humanos da pilha de haste (hiPSC-CMs+ ri) antes da implantação conduz a uma melhoria da taxa do Engraftment da pilha em um modelo do rato do infarction miocárdico agudo (MI). Aqui, nós descrevemos um procedimento completo da diferenciação, da purificação, e do pré-tratamento da pilha do hiPSC-CMs com Y-27632, assim como a contração resultante da pilha, as medidas transientes do cálcio, e a transplantação em modelos do rato MI. O método proposto fornece um método simples, seguro, eficaz e de baixo custo que aumenta significativamente a taxa de Engraftment celular. Este método não pode somente ser usado conjuntamente com outros métodos para realçar mais a eficiência da transplantação da pilha mas igualmente fornece uma base favorável para o estudo dos mecanismos de outras doenças cardíacas.

Introduction

As terapias baseadas em células-tronco mostraram um potencial considerável como um tratamento para danos cardíacos causados pelo MI1. O uso de hiPSCs diferenciados fornece uma fonte inesgotável de hiPSC-CMs2 e abre a porta para o rápido desenvolvimento de tratamentos inovadores. Entretanto, muitas limitações à tradução terapêutica permanecem, incluindo o desafio da taxa severamente baixa do Engraftment de pilhas implantadas.

Dissociar células com tripsina inicia anoikis3, que só é acelerado uma vez que estas células são injetadas em ambientes agressivos como o miocárdio isquêmico, onde o ambiente hipóxico acelera o curso em direção à morte celular. Das células remanescentes, uma grande proporção é lavada do local de implantação para a corrente sanguínea e se espalhou por toda a periferia. Uma das principais vias apoptóticas é a via RhoA/ROCK4. Com base em pesquisas anteriores, a via Rhoa/rock regula a organização citoesquelética actina5,6, que é responsável pela disfunção celular7,8. O inibidor da rocha Y-27632 é amplamente utilizado durante a dissociação e passaging de células estéticas e somáticas, para aumentar a adesão celular e reduzir a apoptose celular9,10,11. Neste estudo, o Y-27632 é usado para tratar o hiPSC-CMs antes da transplantação na tentativa de aumentar a taxa do Engraftment da pilha.

Vários métodos destinados a melhorar a taxa de Engraftment celular, tais como choque térmico e revestimento da matriz de membrana basal12, foram estabelecidas. Além desses métodos, a tecnologia genética também pode promover a proliferação de cardiomiócitos13 ou células não miocárdicas reversas em cardiomiócitos14. Do ponto de vista da bioengenharia, os cardiomiócitos são semeados em um andaime biomaterial para melhorar a eficiência do transplante15. Infelizmente, a maioria destes métodos são complicados e dispendiosos. Pelo contrário, o método proposto aqui é simples, econômico e efetivo, podendo ser utilizado como tratamento basal antes do transplante, bem como na conjugação com outras tecnologias.

Protocol

Todos os procedimentos animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham e foram baseados nos institutos nacionais de saúde laboratório de cuidados com os animais e diretrizes de uso (NIH publicação não 85-23). 1. preparação de meios de cultura e placas de cultura Preparação média Para o meio hiPSC, misture 400 mL de meio basal de células-tronco pluripote…

Representative Results

O hiPSC-CMs usado neste estudo foi derivado da origem humana com o gene do repórter do luciferase; Conseqüentemente, a taxa de sobrevivência das pilhas transplantadas in vivo foi detectada pela imagem latente do bioluminescência (bli)17 (Figura 1a, B). Para as seções histológicas do coração, a troponina cardíaca humana-específica T (hctnt) e o antígeno nuclear humano (HNA) pilhas dobro-positivas foram class…

Discussion

Os principais passos deste estudo incluem a obtenção de Hisc-CMs puro, melhorando a atividade do hiPSC-CMs através do pré-tratamento Y-27632 e, finalmente, transplantar uma quantidade exata de hiPSC-CMs em um modelo de MI do mouse.

As principais questões abordadas aqui foram que, primeiro, otimizamos os métodos de purificação sem glicose19 e estabelecemos um novo sistema de purificação eficiente. O procedimento de sistema incluiu a aplicação de enzimas de di…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem ao Dr. Joseph C. Wu (Universidade de Stanford) por gentilmente fornecer o constructo Fluc-GFP e o Dr. Yanwen Liu para uma excelente assistência técnica. Este estudo é apoiado pelos institutos nacionais de saúde RO1 concede HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), e HL121206A1 (a L.Z.), e um R56 conceder HL142627 (a W.Z.), uma associação americana de desenvolvimento do cientista do coração Grant 16SDG30410018, e a Universidade de Alabama na concessão do desenvolvimento da faculdade de Birmingham (a W.Z.).

Materials

Reagent
Accutase (stem cell detachment solution) STEMCELL Technologies #07920
B27 minus insulin Fisher Scientific A1895601
B27 Supplement Fisher Scientific 17-504-044
CHIR99021 Stem Cell Technologies 72054
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red Thermofisher 20163029
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11150
Fluo-4 AM (calcium indicator) Invitrogen/Thermofisher F14201
Glucose-free RPMI 1640 Fisher Scientific 11879020
IWR1 Stem Cell Technologies 72562
Matrigel (extracellular matrix ) Fisher Scientific CB-40230C
mTeSR (human pluripotent stem cells medium) STEMCELL Technologies 85850
Pen-strep antibiotic Fisher Scientific 15-140-122
Pluronic F-127 (surfactant polyol) Sigma-Aldrich P2443
Rho activator II Cytoskeleton CN03
RPMI1640 Fisher Scientific 11875119
Sodium DL-lactate Sigma-Aldrich L4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes) Fisher Scientific 12-605-010
Verapamil Sigma-Aldrich V4629
Y-27632 STEMCELL Technologies 72304
Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments PerkinElmer CLS136334
15 mm Coverslips Warner CS-15R15
Centrifuge Eppendorf 5415R
Confocal Microscope Olympus IX81
Cryostat Thermo Scientific NX50
Dual Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-344B
Electrophoresis Power Supply BIO-RAD 1645050
Fluoresence Microscope Olympus IX83
High Speed Camera pco 1200 s
Laser Scan Head Olympus FV-1000
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) Warner Instruments RC-42LP
Microincubation System Warner Instruments DH-40iL
Minivent Mouse Ventilator Harvard Apparatus 845
NOD/SCID mice Jackson Laboratory 001303
Precast Protein Gels BIO-RAD 4561033
PVDF Transfer Packs BIO-RAD 1704156
Trans-Blot System BIO-RAD Trans-Blot Turbo
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Name Company Catalog Number Comments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) Abcam ab198580
Cardiac Troponin T R&D Systems MAB1874
Cardiac Troponin C Abcam ab137130
Cardiac Troponin I Abcam ab47003
Cy5-donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch Laboratory 715-175-150
Cy3-donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch Laboratory 711-165-152
Fitc-donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch Laboratory 715-095-150
GAPDH Abcam ab22555
Human Cardiac Troponin T Abcam ab91605
Integrin β1 Abcam ab24693
Ki67 EMD Millipore ab9260
N-cadherin Abcam ab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2 Cell Signaling Technology 3671s
Name Company Catalog Number Comments
Software
Matlab MathWorks R2016A
Image J NIH 1.52g

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Citer Cet Article
Zhao, M., Tang, Y., Ernst, P. J., Kahn-Krell, A., Fan, C., Pretorius, D., Zhu, H., Lou, X., Zhou, L., Zhang, J., Zhu, W. Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity. J. Vis. Exp. (149), e59452, doi:10.3791/59452 (2019).

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