Migliorare l'innesto dei Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo attraverso un'inibizione transitoria dell'attività di Rho Kinase
Summary
In questo protocollo, dimostriamo ed elaboriamo su come utilizzare cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo per la differenziazione e la purificazione cardiomiocitati, e ulteriormente, su come migliorare la sua efficienza di trapianto con inibitore della chinasi proteica associata a Rho pretrattamento in un modello di infarzione miocardico del topo.
Abstract
Un fattore cruciale per migliorare l’efficacia della terapia cellulare per la rigenerazione miocardiale è quello di aumentare in modo sicuro ed efficiente il tasso di innesto cellulare. Y-27632 è un inibitore altamente potente della proteina chinasi (RhoA/ROCK) associata al Rho, associata a Bobina, e viene utilizzata per prevenire l’apoptosi cellulare indotta dalla dissociazione (anoikis). Dimostriamo che il pretrattamento di Y-27632 per cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall’uomo (hiPSC-CMs-RI) prima dell’impianto risultati in un miglioramento del tasso di innesto cellulare in un modello murino di infarzione miocardiale acuta (MI). Qui, descriviamo una procedura completa di differenziazione hiPSC-CMs, purificazione e pretrattamento cellulare con Y-27632, così come la contrazione cellulare risultante, le misurazioni transitorie del calcio e il trapianto in modelli MI murini. Il metodo proposto fornisce un metodo semplice, sicuro, efficace e a basso costo che aumenta significativamente il tasso di innesto cellulare. Questo metodo non può essere utilizzato solo in combinazione con altri metodi per migliorare ulteriormente l’efficienza del trapianto di cellule, ma fornisce anche una base favorevole per lo studio dei meccanismi di altre malattie cardiache.
Introduction
Le terapie basate sulle cellule staminali hanno mostrato un notevole potenziale come trattamento per danni cardiaci causati da MI1. L’uso di hiPSC differenziati fornisce una fonte inesauribile di hiPSC-CMs2 e apre le porte al rapido sviluppo di trattamenti innovativi. Tuttavia, rimangono molte limitazioni alla traduzione terapeutica, tra cui la sfida del tasso di innesto gravemente basso delle cellule impiantate.
Dissociando le cellule con trypsin avvia anoikis3, che viene accelerato solo una volta che queste cellule vengono iniettate in ambienti duri come il miocardio ischemico, dove l’ambiente ipossico accelera il percorso verso la morte cellulare. Delle cellule rimanenti, gran parte viene sbiadita dal sito di impianto nel flusso sanguigno e si diffonde in tutta la periferia. Uno dei percorsi apoptotici chiave è il percorso RhoA/ROCK4. Sulla base di ricerche precedenti, il percorso RhoA/ROCK regola l’organizzazione actin cytoskeletal5,6, che è responsabile della disfunzione cellulare7,8. L’inibitore ROCK Y-27632 è ampiamente utilizzato durante la dissociazione e il passaggio delle cellule somatiche e staminali, per aumentare l’adesione cellulare e ridurre l’apoptosi cellulare9,10,11. In questo studio, Y-27632 viene utilizzato per trattare hiPSC-CMs prima del trapianto nel tentativo di aumentare il tasso di innesto cellulare.
Sono stati stabiliti diversi metodi volti a migliorare il tasso di innesto cellulare, come lo shock termico e il rivestimento a matrice della membrana del seminterrato12. Oltre a questi metodi, la tecnologia genetica può anche promuovere la proliferazione cardiomiocita13 o invertire le cellule non miocardiche in cardiomiociti14. Dal punto di vista della bioingegneria, i cardiomiociti vengono seminato su uno scaffold biomateriale per migliorare l’efficienza dei trapianti15. Purtroppo, la maggior parte di questi metodi sono complicati e costosi. Al contrario, il metodo qui proposto è semplice, conveniente ed efficace, e può essere utilizzato come trattamento basale prima del trapianto, così come in coniugazione con altre tecnologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi chiave di questo studio includono l’ottenimento di hiPSC-CMs puri, il miglioramento dell’attività di hiPSC-CMs attraverso il pretrattamento Y-27632 e, infine, il trapianto di una quantità precisa di hiPSC-CMs in un modello di MI del topo.
Le questioni chiave affrontate qui sono state che, in primo luogo, abbiamo ottimizzato i metodi di purificazione senza glucosio19 e stabilito un nuovo sistema di purificazione efficiente. La procedura di sistema ha incluso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Joseph C. Wu (Stanford University) per aver gentilmente fornito il costrutto Fluc-GFP e il Dr. Yanwen Liu per un’eccellente assistenza tecnica. Questo studio è sostenuto dal National Institutes of Health RO1 concede HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (per J.) e HL121206A1 (a Los Angeles) e una sovvenzione R56 HL142627 (per W.) 16SDG30410018, e l’Università dell’Alabama a Birmingham Faculty Development Grant (a W. .
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
