Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia
Summary
Las imágenes espectrales se han convertido en una solución fiable para la identificación y separación de múltiples señales de fluorescencia en una sola muestra y pueden distinguir fácilmente las señales de interés del fondo o la autofluorescencia. Las imágenes hiperespectrales de análisis de excitación mejoran esta técnica al reducir el tiempo de adquisición de imagen necesario y, al mismo tiempo, aumentar la relación señal-ruido.
Abstract
Varias técnicas se basan en la detección de señales de fluorescencia para identificar o estudiar fenómenos o para dilucidar funciones. La separación de estas señales de fluorescencia se demostró engorrosa hasta el advenimiento de imágenes hiperespectrales, en las que las fuentes de fluorescencia pueden separarse entre sí, así como de las señales de fondo y la autofluorescencia (dado el conocimiento de su firmas). Sin embargo, las imágenes hiperespectrales tradicionales de escaneo de emisiones sufren de tiempos de adquisición lentos y bajas relaciones señal-ruido debido al filtrado necesario de excitación y luz de emisión. Se ha demostrado anteriormente que las imágenes hiperespectrales de análisis de excitación reducen el tiempo de adquisición necesario y al mismo tiempo aumentan la relación señal-ruido de los datos adquiridos. Utilizando equipos disponibles comercialmente, este protocolo describe cómo ensamblar, calibrar y utilizar un sistema de microscopía de imágenes hiperespectrales de escaneo de excitación para la separación de señales de varias fuentes de fluorescencia en una sola muestra. Si bien es muy aplicable a las imágenes microscópicas de células y tejidos, esta técnica también puede ser útil para cualquier tipo de experimento que utilice fluorescencia en la que es posible variar las longitudes de onda de excitación, incluyendo pero no limitado a: imágenes químicas, aplicaciones ambientales, el cuidado de los ojos, la ciencia de los alimentos, la ciencia forense, la ciencia médica y la mineralogía.
Introduction
Las imágenes espectrales se pueden realizar de diversas maneras y se hace referencia a varios términos1,2,3,4. En general, las imágenes espectrales se refieren a datos adquiridos en al menos dos dimensiones espaciales y una dimensión espectral. Las imágenes multiespectrales e hiperespectrales se distinguen con mayor frecuencia por el número de bandas de longitud de onda o si las bandas espectrales son contiguas1. Para esta aplicación, los datos hiperespectrales se definen como datos espectrales adquiridos con bandas de longitud de onda contiguas alcanzadas por el espaciado de longitudes de onda centrales no menos de la mitad de la anchura completa a la mitad máxima (FWHM) de cada filtro de paso de banda utilizado para la excitación (es decir, 5 nm espaciado de longitud de onda central para filtros de paso de banda con anchos de banda de 14-20 nm). La naturaleza contigua de las bandas de datos permite un sobremuestreo del conjunto de datos, asegurando que se cumplan los criterios de Nyquist al muestrear el dominio espectral.
Las imágenes hiperespectrales fueron desarrolladas por la NASA en las décadasde 1970 y 1980 en conjunto con el primer satélite Landsat 5,6. La recopilación de datos de varias bandas espectrales contiguas permitió la generación de un espectro de resplandor de cada píxel. La identificación y definición del espectro de resplandor de componentes individuales permitió no sólo detectar materiales superficiales por sus espectros característicos, sino que también permitió la eliminación de señales intervinientes, como variaciones en la señal debido a condiciones atmosféricas. El concepto de detección de materiales utilizando sus espectros característicos se aplicó a los sistemas biológicos en 1996, cuando Schrock et al. utilizaron combinaciones de cinco fluoróforos diferentes y sus espectros conocidos para distinguir los cromosomas etiquetados en un proceso denominado cariotipado espectral7. Esta técnica fue elaborada en 2000 por Tsurui et al. para la toma de imágenes de fluorescencia de muestras de tejido, utilizando siete colorantes fluorescentes y descomposición de valor singular para lograr la separación espectral de cada píxel en combinaciones lineales de espectros en la referencia biblioteca8. Al igual que sus contrapartes de teledetección, la contribución de cada fluoróforo conocido se puede calcular a partir de la imagen hiperespectral, dada la información a priori del espectro de cada fluoróforo.
También se han utilizado imágeneshiperespectrales en las áreas de agricultura 9, astronomía10,biomedicina11, imágenes químicas12,aplicaciones ambientales13,atención ocular14, ciencia de los alimentos15, ciencias forenses16,17, ciencias médicas18, mineralogía19,y vigilancia20. Una limitación clave de los sistemas de imágenes hiperespectrales del microscopio de fluorescencia actual es que la tecnología de imágenes hiperespectrales estándar aísla las señales de fluorescencia en bandas estrechas por 1) primero filtrando la luz de excitación para controlar la excitación de la muestra, luego 2) filtrado adicional de la luz emitida para separar la emisión de fluorescencia en bandas estrechas que más tarde se pueden separar matemáticamente21. Filtrar tanto la iluminación de excitación como la fluorescencia emitida reduce la cantidad de señal disponible, lo que reduce la relación señal-ruido y requiere largos tiempos de adquisición. La señal baja y los largos tiempos de adquisición limitan la aplicabilidad de las imágenes hiperespectrales como herramienta de diagnóstico.
Se ha desarrollado una modalidad de imagen que hace uso de imágenes hiperespectrales pero potencia la señal disponible, reduciendo así el tiempo de adquisición necesario21,22. Esta nueva modalidad, llamada imagen hiperespectral de análisis de excitación, adquiere datos de imágenes espectrales variando la longitud de onda de excitación y recopilando una amplia gama de luz emitida. Se ha demostrado anteriormente que esta técnica produce órdenes de aumentos de magnitud en la relación señal-ruido en comparación con las técnicas de escaneo de emisiones21,22. El aumento de la relación señal-ruido se debe en gran medida al paso de banda ancho (600 nm) de luz de emisión detectada, mientras que la especificidad se proporciona filtrando sólo la luz de excitación en lugar de la emisión de fluorescencia. Esto permite que todas las luzs emitidas (para cada longitud de onda de excitación) lleguen al detector21. Además, esta técnica se puede utilizar para discriminar la autofluorescencia de etiquetas exógenas. Además, la capacidad de reducir el tiempo de adquisición debido al aumento de la señal detectable reduce el peligro de fotoblanqueo, así como permite escaneos espectrales a una velocidad de adquisición que es aceptable para la imagen de video espectral.
El objetivo de este protocolo es servir como una guía de adquisición de datos para la microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación. Además, se incluyen descripciones que ayudan a entender la ruta de luz y el hardware. También se describe la implementación de software de código abierto para un microscopio de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación. Por último, se proporcionan descripciones sobre cómo calibrar el sistema a un estándar rastreable por NIST, ajustar la configuración de software y hardware para obtener resultados precisos y desmezclar la señal detectada en contribuciones de componentes individuales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso óptimo de una configuración de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación comienza con la construcción de la trayectoria de luz. En particular, la elección de la fuente de luz, los filtros (ajustables y dicoicos), el método de conmutación de filtros y la cámara determinan el rango espectral disponible, la posible velocidad de escaneo, la sensibilidad del detector y el muestreo espacial. Las lámparas de arco de mercurio ofrecen muchos picos de longitud de onda de excitación, pero no proporciona…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el apoyo de NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, y el Fondo de Investigación de Cáncer.
Materials
| Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
| Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
| Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
| Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
| Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
| Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
| Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
| Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
| Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
| GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
| Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
| Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
| Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
| Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
| Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |
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