蛍光信号を効率的に判別する励起走査察ハイパースペクトルイメージング顕微鏡

スペクトルイメージングは、様々な方法で行われ、いくつかの用語1、2、3、4によって参照される。一般に、スペクトルイメージングとは、少なくとも2つの空間次元と1つのスペクトル次元で取得されたデータをいう。マルチスペクトルおよびハイパースペクトルイメージングは、ほとんどの場合、波長帯の数またはスペクトルバンドが連続して¹であるかどうかによって区別されます。このアプリケーションでは、ハイパースペクトルデータは、励起に使用される各バンドパスフィルタの半分の最大(FWHM)で全幅の半分以下の中心波長の間隔によって達成される連続した波長帯で取得されたスペクトルデータとして定義されます(すなわち、5 nm)14-20 nmの帯域幅を持つバンドパスフィルタのための中心波長間隔)。データ バンドの性質が連続しているので、データセットのオーバーサンプリングが可能で、スペクトル ドメインのサンプリング時にナイキストの基準が満たされます。

ハイパースペクトルイメージングは、1970年代と1980年代にNASAによって最初のランドサット衛星5、6と共に開発されました。複数の連続したスペクトルバンドからデータを収集すると、各ピクセルの輝度スペクトルの生成が可能になります。個々の成分の輝度スペクトルを特定して定義することで、その特性スペクトルによって表面材料を検出するだけでなく、信号の変動などの介在信号の除去も可能になりました。大気条件。その特性スペクトルを用いた物質検出の概念は、Shröckらが5つの異なる蛍光体と既知のスペクトルの組み合わせを使用して、呼ばれるプロセスで標識染色体を区別するために1996年に生物学的システムに適用されました。スペクトルカリオタイピング⁷.この技術は、2000年に鶴井らによって組織サンプルの蛍光イメージングのために、7つの蛍光色素と特異値分解を用いて、各ピクセルのスペクトル分離を参照のスペクトルの線形組み合わせに達成するために精緻化された。図書館⁸.彼らのリモートセンシング対応と同様に、各既知の蛍光体の寄与度は、各蛍光体のスペクトルの先行情報を与えられたハイパースペクトル画像から計算することができる。

ハイパースペクトルイメージングは、農業9、天文学10、生物医学11、化学^{イメージング12、}環境応用13、アイケア14、食品^科学15の分野でも使用されています。法医学^16,17, 医学¹⁸, 鉱物学¹⁹, および監視²⁰.現在の蛍光顕微鏡ハイパースペクトルイメージングシステムの主な制限は、標準的なハイパースペクトルイメージング技術が1)最初に励起光を濾過してサンプル励起を制御し、次に狭いバンドで蛍光信号を単離するということです。2)さらに、発光した光をフィルタリングして、蛍光発光を後で数学的に分離できる狭いバンドに分離する21。励起照明と放出蛍光の両方をフィルタリングすると、使用可能な信号の量が減少し、信号対雑音比が低下し、取得時間が長くなります。信号が小さくなり、取得時間が長いため、診断ツールとしてのハイパースペクトルイメージングの適用性が制限されます。

ハイパースペクトルイメージングを利用するが、利用可能な信号を高め、それによって必要な集録時間21、22を減らすイメージ投射様式が開発された。この新しいモダリティは、励起走査熱ハイパースペクトルイメージングと呼ばれ、励起波長を変化させ、広範囲の放射光を収集することにより、スペクトル画像データを取得します。この技術は、発光走査技術21、22と比較して、信号対雑音比の桁増加の桁数が増加することが以前に示されている。信号対雑音比の増加は、検出された発光の広帯域パス(約600nm)によるもので、特異性は蛍光発光の代わりに励起光のみをフィルタリングすることによって提供されます。これにより、すべての放出された光(すべての励起波長)が検出^器21に到達することができます。さらに、この技術は、外因性標識から自己蛍光を区別するために使用することができる。さらに、検出可能な信号の増加による集録時間を短縮できるため、光漂白の危険性が低減され、スペクトルビデオイメージングに許容される集録速度でスペクトルスキャンが可能になります。

このプロトコルの目的は、励起スキャンハイパースペクトルイメージング顕微鏡のデータ集録ガイドとして機能することです。さらに、ライト パスとハードウェアを理解するのに役立つ説明が含まれています。また、励起走査熱ハイパースペクトルイメージング顕微鏡用のオープンソースソフトウェアの実装についても説明する。最後に、NISTトレーサブル標準にシステムを校正し、正確な結果を出すためにソフトウェアとハードウェアの設定を調整し、検出された信号を個々のコンポーネントからの寄与にミックス解除する方法について説明します。