Design af cecal ligation og punktering og intranasal infektion Dual model af sepsis-induceret immunsuppression
Summary
Denne protokol beskriver teknikker til at måle infektiøse resultater underliggende sekundære hospitalserhvervede infektioner i immunsuppressiv tilstand, først ved at etablere cecal ligation/punktering mus derefter udfordre dem med intranasal infektion til at skabe en klinisk relevant model for immun undertrykkelses sepsis.
Abstract
Sepsis, en alvorlig og kompliceret livstruende infektion, er karakteriseret ved en ubalance mellem Pro-og anti-inflammatoriske reaktioner i flere organer. Med udviklingen af terapier, de fleste patienter overlever den hyperinflammatoriske fase, men fremskridt til en immunosuppressiv fase, som øger fremkomsten af sekundære infektioner. Derfor er bedre forståelse af patogenesen underliggende sekundære hospitalserhvervede infektioner i den immunosuppressive fase under sepsis er af enorm betydning. Rapporteret her er en model til at teste infektiøse resultater ved at skabe dobbelt-hit infektioner i mus. En standard kirurgisk procedure anvendes til at inducere polymikrobiel peritonitis ved cecal ligation og punktering (CLP) og efterfulgt af intranasal infektion af Staphylococcus aureus for at simulere lungebetændelse, der forekommer i immunsuppression, som ofte ses hos septiske patienter. Denne dobbelte model kan afspejle den Immunsuppressive tilstand, der forekommer hos patienter med langvarig sepsis og modtagelighed for sekundær infektion fra nosokomiel pneumoni. Derfor, denne model giver en simpel eksperimentel tilgang til at undersøge Patofysiologi af sepsis-induceret sekundær bakteriel lungebetændelse, som kan bruges til at opdage nye behandlinger for sepsis og dens komplikationer.
Introduction
Sepsis indleder et komplekst samspil af Host pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske processer og er karakteriseret ved en hyperinflammatorisk respons og efterfølgende immun dysfunktion1,2. Sepsis er en global sundhedsprioritet og forårsager et stort antal dødsfald i intensivafdelinger (ICUs)3. Incidensen af sepsis skønnes at overstige 30.000.000 tilfælde på verdensplan om året, med dødeligheden så høj som 30% trods fremskridt i ICU Management4,5. I 2017 vedtog Verdenssundhedsorganisationen en resolution, der skulle forbedre forebyggelsen, diagnosticeringen og håndteringen af denne dødelige sygdom5. Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at døden ikke skyldes primær infektion hos svære septiske patienter, men snarere fra sekundær nosokomiel infektion (især lungebetændelse), der forårsages af immunsuppression6,7 . Derfor, forstå mekanismerne for, hvorfor septikpatienter udvikle sekundær infektion og opdage mere effektive behandlinger er bydende nødvendigt. Heri, en dobbelt model, også kendt som en dobbelt-hit model, at studere det immunosuppressive fænomen forekommer hos patienter med langvarig sepsis er beskrevet.
Som den gyldne standard eksperimentel model i forskning på polymikrobiel sepsis, cecal ligation og punktering (CLP) er en operation karakteriseret ved cecum ligation og perforation, som bidrager til polymikrobiel peritonitis og sepsis8,9 . Den patofysiologiske proces og cytokin profilerne, sammen med kinetik og størrelsesorden, svarer til klinisk sepsis. Positionen af ligation, nålestørrelse, der anvendes til punktering, og antallet af cecal punkteringer er vigtige faktorer, der påvirker dødeligheden efter CLP.
Den nosokomielle lungebetændelse er den førende årsag til dødelighed blandt kritisk syge patienter med sepsis. Den vigtigste type organismer, der forårsager svær sepsis, omfatter Staphylococcus aureus (20,5%), Pseudomonas Species (19,9%), Enterobacteriacae (hovedsagelig E. coli, 16,0%) og svampe (19%). I mellemtiden, nylige undersøgelser har antydet en stigende forekomst af gram-positive organismer, som nu er næsten lige så almindeligt som gram-negative infektioner3.
Den metode, der er beskrevet i denne protokol involverer CLP, udført som “første hit” for at inducere subletale polymikrobiel peritonitis, som manifesterer en immunsuppression tilstand. Proceduren indebærer også efterfølgende intranasal instillation af S. aureus som det “andet hit” for at levere en klinisk relevant forskningsplatform.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som guld standardmodel for sepsis forskning, har CLP en kombination af tre fornærmelser, herunder væv traumer forårsaget af laparotomi, nekrose på grund af ligation af cecum, og infektion som følge af mikrobiel lækage, der forårsager peritonitis med translokation af bakterier i blodet8. Derfor, CLP efterligner kompleksiteten af humant sepsis bedre end mange andre modeller. Men en væsentlig begrænsning af den nuværende CLP-model er den manglende evne til at afspejle den mere langvarige fa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhedsydelser R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, og AI097532-01A1 til M. W. Universitetet i North Dakota Core faciliteter blev støttet af NIH tilskud (INBRE P20GM103442 og COBRE P20GM113123). Dette arbejde blev også støttet af Key program af national Nature Science Foundation i Kina (81530063) til Jianxin Jiang. Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og-analyse, beslutning om udgivelse eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker Marvin Leier (Center for Landbo sundhed, University of North Dakota) for at gøre videoen.
Materials
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system’s role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis. Virulence. 5 (1), 4-11 (2014).
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority – A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis?. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
