Progettazione del doppio modello di legatura e puntura ceca dell'infezione intranasale dell'immunosoppressione indotta dalla sepsi
Summary
Questo protocollo descrive le tecniche per misurare gli esiti infettivi alla base delle infezioni ospedaliere secondarie acquisite in ospedale nella condizione immunosoppressiva, prima istituendo topi di legatura/foratura della ceca e poi sfidandoli con infezioni intranasali creare un modello clinicamente rilevante di sepsi immunosoppressione.
Abstract
La sepsi, un’infezione pericolosa per la vita grave e complicata, è caratterizzata da uno squilibrio tra risposte pro e antinfiammatorie in più organi. Con lo sviluppo delle terapie, la maggior parte dei pazienti sopravvive alla fase iperinfiammatoria, ma progredisce verso una fase immunosoppressiva, che aumenta l’emergere di infezioni secondarie. Pertanto, una migliore comprensione della patogenesi alla base delle infezioni ospedaliere secondarie acquisite in ospedale nella fase immunosoppressiva durante la sepsi è di enorme importanza. Segnalato qui è un modello per testare i risultati infettivi creando infezioni a doppio colpo nei topi. Una procedura chirurgica standard viene utilizzata per indurre la peritonite polimicrobica mediante legatura e puntura (CLP) e seguita da un’infezione intranasale dello Staphylococcus aureus per simulare la polmonite che si verifica nella soppressione immunitaria che si vede frequentemente in pazienti settici. Questo doppio modello può riflettere lo stato immunosoppressivo che si verifica in pazienti con sepsi prolungata e suscettibilità all’infezione secondaria da polmonite nosocomiale. Quindi, questo modello fornisce un semplice approccio sperimentale per studiare la fisiopatologia della polmonite batterica secondaria indotta dalla sepsi, che può essere utilizzata per scoprire nuovi trattamenti per la sepsi e le sue complicazioni.
Introduction
Sepsis avvia un complesso gioco di processi pro-infiammatori e antinfiammatori dell’ospite ed è caratterizzato da una risposta iperinfiammatoria e dalla conseguente disfunzione immunitaria1,2. La sepsi rappresenta una priorità sanitaria globale e causa un elevato numero di decessi nelle unità di terapia intensiva (ICU)3. Si stima che l’incidenza della sepsi superi i 30 milioni di casi in tutto il mondo all’anno, con tassi di mortalità fino al 30% nonostante i progressi nella gestione delle unità di terapia intensiva4,5. Nel 2017, l’Organizzazione Mondiale della Sanità ha adottato una risoluzione per migliorare la prevenzione, la diagnosi e la gestione di questa malattia mortale5. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che la morte non deriva da infezione primaria in pazienti settici gravi, ma piuttosto da infezione nosocomiale secondaria (in particolare polmonite) causata dall’immunosoppressione6,7 . Pertanto, è urgente comprendere i meccanismi del perché i pazienti settici sviluppano infezioni secondarie e scoprono trattamenti più efficaci. Qui, viene descritto un doppio modello, noto anche come modello a doppio colpo, per studiare il fenomeno immunosoppressivo che si verifica nei pazienti con sepsi prolungata.
Poiché il modello sperimentale gold standard nella ricerca sulla sepsi polimicrobica, la legatura e la puntura della ceca (CLP) è un intervento chirurgico caratterizzato da legatura e perforazione del cecum, che contribuisce alla peritonite polimicrobica e alla sepsi8,9 . Il processo patofisiologico e i profili di citochina, insieme alla cinetica e alla grandezza, sono simili alla sepsi clinica. La posizione della legatura, la dimensione dell’ago utilizzato per la puntura e il numero di forature del ceca sono fattori importanti che influenzano la mortalità dopo il CLP.
La polmonite nosocomiale è la principale causa di mortalità tra i pazienti gravemente malati di sepsi. Il principale tipo di organismi che causano sepsi grave sono lo Staphylococcus aureus (20,5%), le specie Pseudomonas (19,9%), le Enterobacteriacae (principalmente E. coli, 16,0%) e i funghi (19%). Nel frattempo, studi recenti hanno suggerito una crescente incidenza di organismi gram-positivi, che ora sono quasi altrettanto comuni delle infezioni gram-negative3.
Il metodo descritto in questo protocollo coinvolge CLP, eseguito come il “primo colpo” per indurre peritonite polimicrobica subletale, che manifesta una condizione di immunosoppressione. La procedura comporta anche la successiva instillazione intranasale di S. aureus come il “secondo colpo” per fornire una piattaforma di ricerca clinicamente rilevante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come modello standard d’oro per la ricerca sulla sepsi, il CLP ha una combinazione di tre insulti, tra cui il trauma tissutale causato dalla laparotomia, la necrosi dovuta alla legatura del cecum e l’infezione a causa di perdite microbiche che causano peritonite con traslocazione di batteri nel sangue8. Pertanto, CLP imita la complessità della sepsi umana meglio di molti altri modelli. Tuttavia, una delle principali limitazioni dell’attuale modello CLP è l’incapacità di riflettere la fase più …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 e AI097532-01A1 a M. W. Le strutture principali dell’Università del Dakota del Nord sono state supportate da sovvenzioni NIH (INBRE P20GM103442 e COBRE P20GM113123). Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Key Program of National Nature Science Foundation of China (81530063) a Jianxin Jiang. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamo Marvin Leier (Center for Rural Health, University of North Dakota) per aver fatto il video.
Materials
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system’s role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis. Virulence. 5 (1), 4-11 (2014).
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority – A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis?. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
