Identificación de factores nucleolares durante la replicación del VIH-1 a través de la inmunoprecipitación de rev y la espectrometría de masas

El núcleo se postula como el suelo de interacción de varios factores de huésped celular y virales necesarios para la replicación viral. El núcleo es una estructura compleja subdividida en tres compartimentos diferentes: el compartimento fibrilar, el compartimento fibrilar denso y el compartimento granular. La proteína HIV-1 Rev se localiza específicamente dentro de compartimentos granulares; sin embargo, se desconoce la razón de este patrón de localización. En presencia de mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones de Rev 4, 5 y 6), Rev mantiene un patrón nucleolar y se ha demostrado previamente para rescatar la replicación del VIH-1_HXB2, sin embargo, con una eficiencia reducida en comparación con WT Rev¹ . Todas las mutaciones de un solo punto son incapaces de sostener el ciclo infeccioso VIH-1_NL4-3. En presencia de múltiples mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones De Rev-NoLS 2 y 9), se ha observado que Rev se dispersa por todo el núcleo y el citoplasma y no ha podido rescatar la replicación del VIH-1_HXB2 ¹. El objetivo de este estudio proteómico es descifrar factores celulares nucleolares y no nucleolares involucrados en la vía infecciosa VIH-1 mediada por Rev. Las condiciones de inmunoprecipitación de Rev se optimizan mediante la interacción con la fosfoproteína nucleolar B23, que previamente se ha demostrado que pierde la interacción con Rev en presencia de mutaciones nucleolares.

Los factores celulares Rev han sido ampliamente estudiados en el pasado; sin embargo, esto se ha hecho en ausencia de patogénesis viral. Una proteína, en particular, que se caracteriza en este estudio a través de la interacción Rev durante la replicación del VIH-1 es la fosfoproteína nucleolar B23 – también llamada nucleofosmina (NPM), numatrina, o NO38 en anfibios^{2,3, 4}. B23 se expresa como tres isoformas (NPM1, NPM2 y NPM3) – todos los miembros de la familia de chaperosina nuclear de nucleophosmin/nucleoplasmina^5,6. El chaperosón molecular NPM1 funciona en el montaje adecuado de nucleosomas, en la formación de complejos proteicos/ácidos nucleicos implicados en las estructuras de alto orden de cromatina^7,8, y en la prevención de la agregación y el desdoblamiento erróneo de las proteínas diana a través de un dominio del núcleo N-terminal (residuos 1-120)⁹. La funcionalidad NPM1 se extiende a la génesis ribosoma a través del transporte de partículas preribosomales entre el núcleo y el citoplasma^10,11, el procesamiento del ARN preribosomal en la secuencia ^{del espaciador transcrito interno 12,13}, y la detención de la agregación nucleolar de proteínas durante el ensamblaje ribosomal^14,15. NPM1 está implicado en la inhibición de la apoptosis¹⁶ y en la estabilización de los supresores tumorales ARF^17,18 y p53^19,revelando su doble papel como factor oncogénico y supresor tumoral. NPM1 participa en las actividades celulares de estabilidad del genoma, replicación centrosoma y transcripción. NPM1 se encuentra en nucleólidos durante la interfase del ciclo celular, a lo largo de la periferia cromosómica durante la mitosis, y en cuerpos prenucleolares (PNB) al final de la mitosis. NPM2 y NPM3 no están tan bien estudiados como NPM1, que sufre niveles alterados de expresión durante la neoplasia maligna^20.

NPM1 está documentado en el cierre nucleocitotoplasmático de varias proteínas nucleares/nucleolares a través de un NES interno y NLS^9,21 y se informó previamente para impulsar la importación nuclear de proteínas VIH-1 Tat y Rev. En presencia de las proteínas de fusión B23-binding-domain—galactosidase, Tat localiza erróneamente dentro del citoplasma y pierde la actividad de transactivación; esto demuestra una fuerte afinidad de Tat para B23². Otro estudio estableció un complejo estable Rev/B23 en ausencia de ARNm que contienen RRE. En presencia de ARNm RRE, Rev se disocia de B23 y se une preferentemente al VIH RRE, lo que conduce al desplazamiento de B23²². Se desconoce dónde, a nivel subnuclear, se lleva a cabo la transactivación de Tat y el proceso de intercambio de Rev de B23 por ARNm del VIH. Ambas proteínas se postulan para entrar en el nucleolus simultáneamente a través de la interacción B23. Se espera la participación de otras proteínas celulares del huésped en la vía nucleolar del VIH. Los métodos descritos en esta investigación proteómica ayudarán a dilucidar la interacción del nucleol con los factores celulares del huésped involucrados durante la patogénesis del VIH-1.

La investigación proteómica se inició a través de la expresión de mutaciones de un solo punto Rev NoLS (M4, M5 y M6) y múltiples sustituciones de arginina (M2 y M9) para la producción de VIH-1_HXB2. En este modelo, una línea celular HeLa que expresa establemente la VIH-1_HXB2 (HLfB) deficiente de Rev está transllenada de mutaciones nucleolares WT Rev y Rev que contienen una etiqueta de bandera al final de los 3′. La presencia de WT Rev permitirá que se produzca replicación viral en el cultivo HLfB, en comparación con las mutaciones Rev-NoLS que no rescatan la deficiencia de Rev (M2 y M9), o permiten que se produzca la replicación viral, pero no tan eficientemente como WT Rev (M4, M5 y M6)¹. El lisato celular se recoge 48 horas más tarde después de la proliferación viral en presencia de la expresión Rev y se somete a inmunoprecipitación con un tampón de lisis optimizado para la interacción Rev/B23. Se describe la optimización del tampón de lisis utilizando diferentes concentraciones de sal, y los métodos de elución de proteínas para HIV-1 Rev se comparan y analizan en geles SDS-PAGE teñidos de plata o coomassie. El primer enfoque proteómico implica el análisis directo de una muestra eluida de WT Rev, M2, M6 y M9 expresados por espectrometría de masas en tándem. Un segundo enfoque por el cual los eludos de WT Rev, M4, M5 y M6 se sometieron a un proceso de extracción de gel se compara con el primer enfoque. Se analiza la afinidad de péptidos con las mutaciones Rev-NoLS en comparación con WT Rev y se muestra la probabilidad de identificación de proteínas. Estos enfoques revelan factores potenciales (nucleolar y no nucleolar) que participan en el transporte y empalme de ARNm VIH-1 con Rev durante la replicación del VIH-1. En general, las condiciones de lisis celular, IP y elución descritas son aplicables a las proteínas virales de interés para la comprensión de los factores celulares del huésped que activan y regulan las vías infecciosas. Esto también es aplicable al estudio de los factores de huésped celular necesarios para la persistencia de varios modelos de enfermedad. En este modelo proteómico, HIV-1 Rev IP está optimizado para la interacción B23 a factores nucleolares dilucidos involucrados en la actividad de cierre nucleocitolasmático y la unión de ARNm VIH-1. Además, se pueden desarrollar líneas celulares que expresan establemente modelos de enfermedades infecciosas que son deficientes para las proteínas clave de interés, similara a la línea celular HLfB, para estudiar las vías infecciosas de interés.