Identification des facteurs nucléoleux pendant la réplication du VIH-1 par l'immunoprécipitation rev et la spectrométrie de masse

Le nucléole est postulé comme le terrain d’interaction de divers facteurs cellulaires et viraux nécessaires à la réplication virale. Le nucléolus est une structure complexe subdivisée en trois compartiments différents : le compartiment fibrillaire, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire. La protéine HIV-1 Rev se localise spécifiquement dans les compartiments granulaires; cependant, la raison de ce modèle de localisation est inconnue. En présence de mutations à un seul point dans la séquence NoLS (Rev mutations 4, 5 et 6), Rev maintient un modèle nucléolif et a déjà été montré pour sauver la réplication VIH-1_HXB2, cependant, avec une efficacité réduite par rapport à WT Rev¹ . Toutes les mutations à un seul point sont incapables de soutenir le cycle infectieux VIH-1_NL4-3. En présence de multiples mutations à un seul point dans la séquence NoLS (mutations Rev-NoLS 2 et 9), Rev a été observé pour se disperser dans le noyau et le cytoplasme et n’a pas été en mesure de sauver la réplication VIH-1_HXB2 ¹. Le but de cette étude protéomique est de déchiffrer les facteurs cellulaires nucléolaux ainsi que non nucléolaux impliqués dans la voie infectieuse du VIH-1 médiée par le révérend. Les conditions d’immunoprécipitation de Rev sont optimisées par l’interaction avec la phosphoprotéine nucléolar B23, qui a été précédemment montrée pour perdre l’interaction avec Rev en présence des mutations nucléolaures.

Les facteurs cellulaires rev ont été largement étudiés dans le passé; cependant, ceci a été fait en l’absence de pathogénie virale. Une protéine, en particulier, qui est caractérisée dans cette étude par l’interaction Rev pendant la réplication du VIH-1 est la phosphoprotéine nucléolée B23 – également appelé nucléophosme (NPM), numatrine, ou NO38 chez les amphibiens^{2,3, 4}. B23 est exprimé en trois isoformes (NPM1, NPM2, et NPM3) – tous les membres de la nucléophosmine/nucléoplasmin famille de chaperon nucléaire^5,6. Le chaperon moléculaire NPM1 fonctionne dans l’assemblage approprié des nucléosomes, dans la formation de complexes protéiques/acides nucléiques impliqués dans les structures de chromatine d’ordre supérieur^7,8, et dans la prévention de l’agrégation et dépliement des protéines cibles à travers un domaine central N-terminal (résidus 1-120)⁹. La fonctionnalité NPM1 s’étend à la genèse ribosome par le transport des particules préribosomal entre le noyau et le cytoplasme^10,11, le traitement de l’ARN préribosomal dans la séquence ^{d’espacer transcrit interne 12,13}, et l’arrestation de l’agrégation nucléolaires de protéines au cours de l’assemblage ribosomal^14,15. NPM1 est impliqué dans l’inhibition de l’apoptose¹⁶ et dans la stabilisation des suppresseurs de tumeur ARF^17,18 et p53¹⁹, révélant son double rôle en tant que facteur oncogène et suppresseur de tumeur. NPM1 participe aux activités cellulaires de stabilité du génome, de réplication centrosome et de transcription. NPM1 se trouve dans les nucléoli pendant l’interphase de cycle cellulaire, le long de la périphérie chromosomique pendant la mitose, et dans les corps prenucléolaire (PNB) à la conclusion de la mitose. NPM2 et NPM3 ne sont pas aussi bien étudiés que NPM1, qui subit des niveaux d’expression altérés pendant la malignité²⁰.

NPM1 est documenté dans l’étanchage nucléocytoplasmique de diverses protéines nucléaires/nucléolées par le biais d’un NES interne et NLS^9,21 et a été précédemment signalé pour conduire l’importation nucléaire de HIV-1 Tat et Rev protéines. En présence de protéines de fusion B23-domaine-galactosidase, Tat se localise mal dans le cytoplasme et perd son activité de transactivation; cela démontre une forte affinité de Tat pour B23². Une autre étude a établi un complexe stable Rev/B23 en l’absence de RNAR contenant du RRE. En présence de l’ARNm RRE, Rev se dissocie de B23 et se lie de préférence à la RRE VIH, conduisant au déplacement de B23²². On ne sait pas où, au niveau subnucléaire, la transactivation de Tat et le processus d’échange de Rev de B23 pour l’ARNm VIH ont lieu. Les deux protéines sont postulées pour entrer dans le nucléole simultanément par l’interaction B23. On s’attend à ce que d’autres protéines cellulaires d’hôte se chez les personnes vivant dans la voie nucléolif du VIH. Les méthodes décrites dans cette enquête protéomique aideront à élucider l’interaction du nucléole avec les facteurs cellulaires d’hôte impliqués pendant la pathogénie de HIV-1.

L’enquête sur la protéomique a été lancée par l’expression de mutations à un seul point du Rev NoLS (M4, M5 et M6) et de multiples substitutions d’arginine (M2 et M9) pour la production de VIH-1_HXB2. Dans ce modèle, une lignée cellulaire HeLa exprimant de façon stable le VIH-1_HXB2 (HLfB) est transfectée avec des mutations nucléolaires WT Rev et Rev contenant une étiquette de drapeau à l’extrémité 3′ La présence de WT Rev permettra à la réplication virale de se produire dans la culture HLfB, par rapport aux mutations Rev-NoLS qui ne sauvent pas l’insuffisance Rev (M2 et M9), ou permettent la réplication virale de se produire, mais pas aussi efficacement que WT Rev (M4, M5, et M6)¹. Le lysate cellulaire est recueilli 48 h plus tard après la prolifération virale en présence de l’expression Rev et soumis à l’immunoprécipitation avec un tampon de lyse optimisé pour l’interaction Rev/B23. L’optimisation de la mémoire tampon de Lyse à l’aide de concentrations variables de sel est décrite, et les méthodes d’élution des protéines pour le VIH-1 Rev sont comparées et analysées dans des gels SDS-PAGE tachés d’argent ou de Coomassie. La première approche protéomique implique l’analyse directe d’un échantillon élucidé de WT Rev, M2, M6 et M9 exprimés par spectrométrie de masse en tandem. Une deuxième approche par laquelle les eluates de WT Rev, M4, M5, et M6 ont subi un processus d’extraction de gel est comparée à la première approche. L’affinité peptide aux mutations de Rev-NoLS par rapport à WT Rev est analysée et la probabilité d’identification de protéine affichée. Ces approches révèlent des facteurs potentiels (nucléolaure et nonnucléolaure) qui participent au transport et à l’épissage de l’ARNm 1 du VIH-1 avec Rev pendant la réplication du VIH-1. Dans l’ensemble, les conditions de lyse cellulaire, de propriété intellectuelle et d’élution décrites s’appliquent aux protéines virales d’intérêt pour la compréhension des facteurs cellulaires de l’hôte qui activent et régulent les voies infectieuses. Ceci est également applicable à l’étude des facteurs d’hôte cellulaire requis pour la persistance de divers modèles de maladie. Dans ce modèle de protéomique, HIV-1 Rev IP est optimisé pour l’interaction B23 pour élucider les facteurs nucléolaux impliqués dans l’activité de fermeture nucléocytoplasmique et la liaison de l’ARNm VIH-1. En outre, des lignées cellulaires exprimant de façon stable des modèles de maladies infectieuses déficientes pour les protéines clés d’intérêt peuvent être développées, semblables à la lignée cellulaire HLfB, pour étudier les voies infectieuses d’intérêt.