通过转版免疫沉淀和质谱测定,在HIV-1复制过程中核子因子的识别

核细胞被假定为病毒复制所需的各种细胞宿主和病毒因子的相互作用场。核细胞是一个复杂的结构,分为三个不同的隔间:纤维室,密集的纤维室和粒状隔间。HIV-1 Rev 蛋白专门在粒状隔间内进行本地化;但是,此本地化模式的原因未知。在 NoLS 序列中存在单点突变(Rev 突变 4、5 和 6)的情况下,Rev 保持核苷酸模式,并且以前曾证明可以挽救 HIV-1_HXB2复制,但与 WT Rev 1 相比,效率降低.所有单点突变都无法维持HIV-1_NL4-3感染周期。在NoLS序列中存在多个单点突变(Rev-NoLS突变2和9)时,已观察到Rev分散在整个细胞核和细胞质,并且未能挽救HIV-1_HXB2复制1。此蛋白质组学研究的目标是破译与 Rev 介导的 HIV-1 感染途径有关的核细胞因子和非核细胞因子。Rev 免疫沉淀条件通过与核蛋白 B23 磷蛋白的相互作用进行优化,该蛋白先前已被证明在存在核突变时与 Rev 失去交互作用。

过去,对细胞因子进行了广泛的研究;然而,这是在没有病毒发病机制的情况下完成的。在这项研究中,通过HIV-1复制过程中的Rev相互作用,一种蛋白质是核磷蛋白B23,也称为核对霉素(NPM)、核糖核酸或NO38(两栖动物2、3)、^4.B23表示为三种同种体(NPM1、NPM2和NPM3)-核素/核质核伴生家族的所有成员5、6。NPM1分子伴菜功能在核小体的适当组装,在染色质高阶结构7,8参与的蛋白质/核酸复合物的形成,以及防止聚集和通过N端核心域(残留物1-120)错误折叠目标蛋白9。NPM1功能通过核细胞核和细胞质10、11、内转录间隔序列^{中前核糖体RNA的处理,扩展到核糖体成因}12,13,并逮捕核蛋白聚合期间核细胞组装14,15。NPM1与抑制凋^亡16和肿瘤抑制剂ARF 17、18和p53¹⁹的致稳定有关,揭示了其作为致癌因子和肿瘤抑制器的双重作用。NPM1参与基因组稳定性、中位复制和转录的细胞活动。NPM1在细胞周期相间的核糖核酸中,在线虫期间沿染色体边缘,在线虫发生结束时在核细胞体(PNB)中发现。NPM2和NPM3的研究不如NPM1,在恶性^肿瘤20期间,NPM1的表达水平发生了改变。

NPM1被记录在各种核/核细胞质穿梭中,通过内部NES和NLS9,21,并以前曾报告推动HIV-1 Tat和Rev蛋白的核进口。在B23结合域-β-乳酸酶融合蛋白的存在下,Tat在细胞质内错位,失去转活活性;这表明Tat对B23²有很强的亲和力。另一项研究在缺乏含有RRE的mRNA的情况下建立了Rev/B23稳定复合物。在RRE mRNA的存在下,Rev与B23分离,优选与HIV RRE结合,导致B232的位移。在亚核水平上,Tat转能和B23HIV mRNA的转用交换过程在哪里发生,目前不得而知。两种蛋白质都假定通过B23相互作用同时进入核素。预期其他宿主细胞蛋白参与HIV核蛋白通路。本蛋白质组学调查中描述的方法将有助于阐明在HIV-1发病机制过程中涉及的核细胞因子与宿主细胞因子的相互作用。

蛋白质组学研究是通过表达Rev NoLS单点突变(M4、M5和M6)和HIV-1_HXB2生产的多种精氨酸替代(M2和M9)开始的。在此模型中,一个HeLa细胞系可稳稳地表达Rev缺陷HIV-1HXB2(HLfB)转染WT Rev和Rev核糖核细胞突变,这些突变在3’末端含有标志标记。WT Rev 的存在将允许病毒复制发生在 HLfB 培养,与不挽救 Rev 缺乏 (M2 和 M9) 的 Rev-NoLS 突变相比,或允许病毒复制发生,但效率不如 WT Rev (M4、M5 和 M6)¹。细胞莱沙在病毒增殖后48小时后在Rev表达的情况下被收集,并在免疫沉淀后使用针对Rev/B23相互作用优化的莱沙缓冲液进行免疫沉淀。介绍了使用不同盐浓度的莱沙缓冲液优化,并在银色或库马西染色SDS-PAGE凝胶中比较和分析HIV-1 Rev的蛋白质洗脱方法。第一种蛋白质组学方法涉及通过串联质谱直接分析来自表达的WT Rev、M2、M6和M9的洗脱样品。第二种方法将WT Rev、M4、M5和M6的改性与第一种方法进行比较。与WT Rev相比,对Rev-NoLS突变的肽亲和力进行了分析,并显示了蛋白质识别概率。这些方法揭示了在HIV-1复制期间参与HIV-1 mRNA传输和与Rev拼接的潜在因素(核核和非核苷酸)。总体而言,所述细胞溶解、IP和洗脱条件适用于感兴趣的病毒蛋白,用于了解激活和调节感染途径的宿主细胞因子。这也适用于研究各种疾病模型的持久性所需的细胞宿主因素。在此蛋白质组学模型中,HIV-1 Rev IP 针对 B23 相互作用进行了优化,以阐明与核细胞质穿梭活动和 HIV-1 mRNA 结合有关的核苷酸因子。此外,可以开发与HLfB细胞系类似的细胞系,以稳稳地表达缺乏关键蛋白质的传染病模型,以研究感兴趣的感染途径。