REV免疫沈殿と質量分析によるHIV-1複製中のヌクレオール因子の同定

核は、ウイルス複製に必要な様々な細胞宿主およびウイルス因子の相互作用場として仮定される。核は3つの異なったコンパートメントに細分される複雑な構造である:フィブリラコンパートメント、密な線維のコンパートメントおよび粒状コンパートメント。HIV-1 Revタンパク質は、粒状コンパートメント内で特異的に局所化します。ただし、このローカリゼーション パターンの理由は不明です。NoLS配列(Rev突然変異4、5、および6)内に単一点突然変異が存在する場合、Revは核パターンを維持し、以前にHIV-1_HXB2複製を救出することが示されているが、WT Rev 1と比較して効率が低下した。.すべての単一点突然変異は、HIV-1_NL4-3感染サイクルを維持することができません。NoLS配列内の複数の単一点突然変異(Rev-NoLS突然変異2および9)の存在下で、Revは核および細胞質全体に分散することが観察され、HIV-1_HXB2^複製1を救出することができませんでした。このプロテオミクス研究の目的は、Rev媒介性HIV-1感染経路に関与するヌクレオラーおよび非ヌクレオロール細胞因子を解読することです。Rev免疫沈殿条件は、ヌクレオラーB23リンタンパク質との相互作用を通じて最適化され、以前にヌクレオラー変異の存在下でRevとの相互作用を失うことが示されている。

Rev細胞因子は、過去に広範囲に研究されています。しかし、これはウイルス病因の不在で行われている。特に、HIV-1複製中のRev相互作用を介して本研究で特徴付けられた1つのタンパク質は、両生類2、3、両生類におけるヌクレオホスミン(NPM)、ヌマトリン、またはNO38とも呼ばれるヌクレオホスミンB23である。^4.B23は、3つのアイソフォーム(NPM1、NPM2、およびNPM3)として表される- 核核ホスミン/核オプラスミン核シャペロンファミリー5、6の全メンバー。NPM1分子シャペロンは、ヌクレオソームの適切な組み立てにおいて、クロマチン高次構造7、8に関与するタンパク質/核酸複合体の形成において、および凝集の防止において機能し、N末端コアドメインを介した標的タンパク質の誤折(残渣1-120)9.NPM1機能は、核と細胞質間のプリリボソーム粒子の輸送を通じてリボソーム発生にまで及び、内部転写スペーサー配列^{におけるプリリボソームRNAの処理12,13,}リボソームアセンブリ14,¹⁵の間にタンパク質の核凝集を逮捕する.NPM1は、アポトー^シス16の阻害および腫瘍抑制剤ARF 17、18およびp53¹⁹の安定化に関与し、発生因子および腫瘍抑制剤としての二重の役割を明らかにする。NPM1は、ゲノム安定性、セントロソーム複製、転写の細胞活動に関与する。NPM1は、細胞周期間相中のヌクレオリ、有人化時の染色体周辺、および有分裂の終わりに核前核体(PNB)に見出される。NPM2およびNPM3は、悪性^腫瘍20の間に発現レベルの変化を受けるNPM1ほどよく研究されていない。

NPM1は、内部ファミコンおよびNLS 9、21を介した様々な核/核系タンパク質の核細胞質シャトルに記載されており、HIV-1タットおよびRevタンパク質の核輸入を促進することが以前に報告されている。B23-結合ドメイン-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質の存在下で、タットは細胞質内で誤局在化し、トランス活性化活性を失う。これはB23²のためのタットの強い親和性を示す。別の研究は、RRE含有mRNAの不在でRev/B23安定複合体を確立した。RRE mRNAの存在下で、RevはB23から解離し、好ましくはHIV RREに結合し、B23²²の変位を引き起こす。核レベルでは、HIV mRNAに対するB23のタットトランス活性化およびRev交換プロセスがどこで起こるかは不明である。両方のタンパク質は、B23相互作用を介して同時に核に入ると仮定される。HIV核経路における他の宿主細胞タンパク質の関与が期待される。このプロテオミクス調査に記載されている方法は、HIV-1病因の間に関与する宿主細胞因子との核の相互作用を解明するのに役立つ。

プロテオミクス調査は、HIV-1_HXB2産生に対するRev NoLS単点変異(M4、M5、およびM6)および複数のアルギニン置換(M2およびM9)の発現を通じて開始された。このモデルでは、Rev欠損HIV-1_HXB2(HLfB)を安定的に発現するHeLa細胞株を、3’末端にフラグタグを含むWT RevおよびRevヌクレオラー変異でトランスフェクトする。WT Revの存在は、Rev欠乏症(M2およびM9)を救済しないRev-NoLS変異と比較して、HLfB培養においてウイルス複製が起こることを可能にする、またはウイルス複製がWT Rev(M4、M5、およびM6)1ほど効率的に起こらないことを可能にする。細胞リサートは、Rev発現の存在下でウイルス増殖後48時間後に収集され、Rev/B23相互作用用に最適化されたリシスバッファーを用いて免疫沈殿を行った。様々な塩濃度を用いた溶解バッファー最適化について説明し、HIV-1 Revのタンパク質溶出方法を銀染色またはクマシー染色SDS-PAGEゲルで比較・分析する。最初のプロテオミクスアプローチは、タンデム質量分析による発現WT Rev、M2、M6、およびM9からの放出サンプルの直接分析を含む。WT Rev、M4、M5、およびM6の溶出をゲル抽出プロセスを受けた第2のアプローチを、第1のアプローチと比較する。WT Revと比較してRev-NoLS変異に対するペプチド親和性を分析し、タンパク質同定確率を表示する。これらのアプローチは、HIV-1 mRNA輸送およびHIV-1複製中のRevとのスプライシングに関与する潜在的な因子(ヌクレオールおよび非ヌクレオラー)を明らかにする。全体的に、記載された細胞溶解、IP、および溶出条件は、感染経路を活性化および調節する宿主細胞因子の理解のために目的とするウイルスタンパク質に適用可能である。これは、様々な疾患モデルの持続性に必要な細胞宿主因子の研究にも適用可能である。このプロテオミクスモデルでは、HIV-1 Rev IPは、核細胞質シャトル活性およびHIV-1 mRNA結合に関与するヌクレオロール因子を解明するためにB23相互作用用に最適化されています。さらに、目的の主要タンパク質に欠乏している感染症モデルを安定的に発現する細胞株は、HLfB細胞株と同様に、目的とする感染経路を研究するために開発することができる。