وكثيراً ما تمارس البروتينات المرتبطة هيكلياً الوظائف البيولوجية المتميزة. تبادل مناطق ما يعادل هذه البروتينات من أجل خلق البروتينات تشيميريك يشكل نهجاً مبتكراً لتحديد المناطق الحرجة البروتين التي المسؤولة عن الاختلاف الوظيفي.
والهدف من هذا البروتوكول يشمل تصميم البروتينات تشيميريك فيها مناطق متميزة من البروتين تحل محلها تسلسل المقابلة في بروتين هيكلياً مشابهة، من أجل تحديد أهمية هذه المناطق الوظيفية. مثل هذه التركيبات يتم إنشاؤها بواسطة بروتوكول PCR متداخلة باستخدام شظايا من الحمض النووي متداخلة والمصممة على نحو كاف الإشعال، متبوعاً بالتعبير عنها ضمن نظام الثدييات لضمان هيكل الثانوية الأصلية والتعديلات بوستترانسلاشونال.
ثم يشار إلى الدور الوظيفي لمنطقة متميزة بفقدان نشاط الوهم في مقايسة قراءات مناسبة. ونتيجة لذلك، يتم تحديد مناطق إيواء مجموعة من الأحماض الأمينية الهامة، التي يمكن أن تكون كذلك فرزهم بتقنيات تكميلية (مثل موقع الموجه الطفرات) لزيادة دقة الجزيئية. على الرغم من أن يقتصر على الحالات التي يمكن العثور على بروتين هيكلياً المتصلة بوظائف مختلفة، البروتينات تشيميريك قد استخدمت بنجاح لتحديد المناطق الحرجة ملزمة في البروتينات مثل السيتوكينات وسيتوكين المستقبلات. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة في الحالات التي لا تكون المناطق الوظيفية للبروتين محددة تحديداً جيدا، ويشكل خطوة أولى قيمة في نهج التطور الموجه لتضييق المناطق ذات الاهتمام وتقليل الجهد الفحص المعنية.
يتم تجميع عدة أنواع من البروتينات، بما في ذلك السيتوكينات وعوامل النمو، في أسر أعضاؤها مشاركة هياكل ثلاثية الأبعاد مشابهة ولكن غالباً ما يمارس الوظائف البيولوجية المتميزة1،2. هذا التنوع الوظيفي هو عادة نتيجة للفروق الصغيرة في تكوين الأحماض الأمينية داخل المواقع النشطة للجزيء3. تحديد هذه المواقع والمحددات الوظيفية لا فقط تقدم أفكاراً قيمة تطورية بل أيضا لتصميم أكثر تحديداً يضع ومثبطات4. ومع ذلك، عدد كبير من الاختلافات في تكوين بقايا كثيرا ما وجدت بين البروتينات المرتبطة هيكلياً تعقيد هذه المهمة. على الرغم من أن تشييد المكتبات الكبيرة التي تحتوي على مئات طفرات في الوقت الحاضر ممكناً، تقييم كل الاختلاف بقايا واحد ولا تزال مجموعات منهم صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً جهد5.
تقنيات تقييم أهمية الوظيفية لمناطق كبيرة من البروتين ذات قيمة للحد من العدد البقايا المحتملة إلى الإدارة رقم6وهكذا. وقد البروتينات مبتوراً النهج الأكثر استخداماً لمعالجة هذه القضية. وبناء على ذلك، تعتبر مناطق ذات الصلة الوظيفية إذا تأثرت بحذف المنطقة خاصة7،،من89وظيفة البروتين قيد الدراسة. ومع ذلك، قيداً رئيسيا لهذا الأسلوب أن الحذف يمكن أن تؤثر على هيكل الثانوية للبروتين، مما يؤدي إلى ميسفولدينج والتجميع وعدم القدرة على دراسة المنطقة المقصودة. مثال جيد هو نسخة مقتطعة من oncostatin سيتوكين M (OSM)، الذي درس حذف داخلية أكبر من بقايا 7 أسفرت عن تجمعات متحولة لا يمكن زيادة10.
ويشكل توليد بروتينات تشيميريك نهج البديلة والمبتكرة التي تسمح بتحليل مناطق أكبر من البروتين. والهدف من هذا الأسلوب تبادل المناطق ذات الاهتمام في بروتين بتسلسل يتصل هيكلياً في بروتين آخر، بغية تقييم مساهمة الفروع حل محل للوظائف البيولوجية المحددة. يستخدم على نطاق واسع في مجال إشارات مستقبلات لتحديد المجالات الوظيفية11،12، البروتينات تشيميريك مفيدة بشكل خاص لدراسة البروتين الأسر مع القليل من الأحماض الأمينية الهوية لكن الهيكل الثانوي المصانة. يمكن العثور على أمثلة المناسبة في الفئة من انترلوكين-6 السيتوكينات (إيل-6) نوع، كعامل نيوروتروفيك انترلوكين-6 والهدبيه (6% تسلسل الهوية)13 أو اللوكيميا العوامل المثبطة (LIF) و OSM (هوية 20%)6، الذي ويستند اتباع البروتوكول.
ويشكل توليد بروتينات تشيميريك تقنية متعددة الاستعمالات، وقادرة على تجاوز حدود البروتينات مبتوراً بمعالجة مسائل مثل الجزئية سيتوكين-مستقبلات ملزم المجالات13. تصميم التركيبات هو خطوة أساسية في هذا النوع من الدراسات، ويتطلب دراسة متأنية. الدراسات الأولية إنشاء مجالات وظيفية ?…
The authors have nothing to disclose.
أيد هذا العمل جمعية ماكس بلانك، و Schüchtermann-العيادة (روثينفيلدي سيئة، ألمانيا). وكان نشر جزء من هذه البحوث في “مجلة الكيمياء البيولوجية”. أدريان-سيغارا، ج. م. شندلر، نون، جاجودا، ص، Lörchner، حاء، براون، ت. & Pöling، ج. حلقة AB ود-الحلزون في ربط الموقع الثالث من م Oncostatin البشرية (OSM) مطلوبة من أجل تنشيط مستقبلات OSM. ج. محاضرة الكيمياء عام 2018؛ 18:7017-7029. © المؤلفين.
Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
LE agarose | Biozym | 840004 | |
Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |