Identificazione delle regioni di proteina funzionale attraverso la proteina chimerica costruzione
Summary
Proteine strutturalmente correlate spesso esercitano funzioni biologiche distinte. Lo scambio di equivalenti regioni di queste proteine al fine di creare proteine chimeriche costituisce un approccio innovativo per identificare le aree critiche della proteina che sono responsabili della loro divergenza funzionale.
Abstract
L’obiettivo del presente protocollo comprende la progettazione di proteine chimeriche in cui regioni distinte di una proteina sono sostituite dai loro corrispondenti sequenze in una proteina strutturalmente simile, al fine di determinare l’importanza funzionale di queste regioni. Tali chimere vengono generate mediante un protocollo PCR annidato utilizzando frammenti di DNA sovrapposti e adeguatamente progettato gli iniettori, seguiti dalla loro espressione all’interno di un sistema mammifero affinché nativo struttura secondaria e post-traduzionali.
Il ruolo funzionale di una distinta regione allora è indicato da una perdita di attività della chimera in un’analisi appropriata lettura. Di conseguenza, le regioni che ospitano una serie di aminoacidi critici sono identificate, che può essere ulteriormente proiettato di tecniche complementari (ad es. mutagenesi sito-diretta) per aumentare la risoluzione molecolare. Anche se limitata a casi in cui una proteina strutturalmente correlata con differenti funzioni può essere trovata, proteine chimeriche sono state impiegate con successo per identificare le aree critiche associazione di proteine come recettori di citochine e citochine. Questo metodo è particolarmente adatto nei casi in cui regioni funzionali della proteina non sono ben definite e costituisce un primo passo importante negli approcci di evoluzione diretto a restringere le regioni di interesse e ridurre lo sforzo di screening.
Introduction
Diversi tipi di proteine, tra cui citochine e fattori di crescita, sono raggruppati in famiglie i cui membri condividono simili strutture tridimensionali ma spesso esercitano funzioni biologiche distinte1,2. Questa diversità funzionale è di solito la conseguenza di piccole differenze nella composizione di aminoacidi all’interno siti attivi3 della molecola. Identificazione di tali siti e funzionali determinanti non solo offrono preziose intuizioni evolutive ma anche per progettare più specifici inibitori e agonisti4. Tuttavia, il gran numero di differenze nella composizione del residuo trovato frequentemente tra proteine strutturalmente correlate complica questo compito. Anche se la costruzione di grandi biblioteche contenenti centinaia di mutanti al giorno d’oggi è fattibile, valutando ogni variazione di singolo residuo e combinazioni di loro rimane ancora un impegnativo e richiede tempo sforzo5.
Tecniche di valutazione l’importanza funzionale delle proteine grandi regioni sono così di valore per ridurre il numero di possibili residui a un numero gestibile6. Proteine tronche sono stati l’approccio più utilizzato per affrontare questo problema. Di conseguenza, le regioni sono considerate essere funzionalmente rilevanti se la funzione della proteina in esame è influenzata tramite l’omissione di una particolare regione7,8,9. Tuttavia, una limitazione importante di questo metodo è che le omissioni possono influenzare la struttura secondaria della proteina, che conduce al misfolding, aggregazione e l’impossibilità di studiare la regione desiderata. Un buon esempio è una versione troncata della citochina oncostatin M (OSM), in cui un’omissione interna più grande di 7 residui ha provocato un mutante misfolded che potrebbe non essere ulteriormente studiato10.
La generazione di proteine chimeriche costituisce un approccio alternativo e innovativo che permette l’analisi delle più grandi regioni della proteina. L’obiettivo di questo metodo è per lo scambio di regioni di interesse in una proteina di sequenze strutturalmente correlate in un’altra proteina, al fine di valutare il contributo delle sezioni sostituite per specifiche funzioni biologiche. Ampiamente usato nel campo della segnalazione recettori per identificare i domini funzionali11,12, proteine chimeriche sono particolarmente utili per lo studio di famiglie di proteine con l’identità dell’amminoacido poco ma conservata struttura secondaria. Esempi appropriati possono essere trovati nella classe di interleukin-6 (IL-6) tipo citochine, come interleukin-6 e ciliary neurotrophic factor (6% identità di sequenza) fattore inibitorio13 o leucemia (LIF) e (20% identità) OSM6, su cui la seguendo il protocollo si basa.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generazione di proteine chimeriche costituisce una tecnica versatile, che è in grado di andare oltre i limiti di proteine tronche per affrontare questioni quali la modularità di citochina-recettore associazione domini13. Il design delle chimere è un passo fondamentale in questo tipo di studi e richiede un’attenta considerazione. Studi preliminari per stabilire domini funzionali generalmente richiederà la sostituzione di vaste regioni in una prima fase, mentre più piccole sostituzioni di lu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla società Max Planck e la Schüchtermann-clinica (Bad Rothenfelde, Germania). Parte di questa ricerca è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, M. J., Schindler, N., gatto, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Il ciclo di AB e D-elica nel sito di legame III di umano Oncostatin M (OSM) sono necessari per l’attivazione del recettore OSM. J Biol Chem. 2018; 18:7017-7029. © gli autori.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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