Immunohistopathologic исследование фолиевая кислота рецепторов бета макрофагов и сосудистой иммунной микроокружения в гигантоклеточная артериальный профиля
Summary
Протокол иллюстрирует использование гистопатологические осмотра и иммуногистохимии профиль макрофагов бета рецепторов фолиевой кислоты и ее отношения с общей иммунных клеток проникнуть в биопсии височной артерии в гигантоклеточная артериальный.
Abstract
Гигантоклеточная артериит (ГКА) является хронической болезнью, связанный иммунной опосредованного артерий среднего и большого размера, затрагивает пожилых людей. GCA манифесты с артритом и окклюзионной симптомы головной боли, инсульта или потери зрения. Макрофаги и лимфоциты Т-хелперами проникнуть сосудистой стенки и производят про воспалительной реакции, которые ведут к судну ущерб и ишемии. На сегодняшний день, есть нет ГЦА биомаркеров, который может контролировать болезнь деятельность и руководство лечебных ответ.
Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosylphosphatidylinositol белок, который является якорь на клеточные мембраны и обычно выражается в линии миеломоноцитная и в большинстве клеток миелоидной лейкемии как опухоли и ревматоидные синовиальной макрофагов, где его выражение коррелирует с тяжести заболевания. FRB возможность привязать фолиевой кислоты соединений, фолиевой кислоты конъюгатов и antifolate наркотиков сделала его druggable цель в рак и воспалительные болезни исследований. В настоящем докладе описываются гистопатологические и иммуногистохимических методов, используемых для оценки выражения и распределение FRB по отношению к GCAimmunopathology.
Формалин исправлена и парафин врезанных височной артерии биопсий ГКА и нормального управления окрашивали гематоксилином и эозином пересмотреть Гистология ткани и определить патогномоничных функции. Иммуногистохимия была использована для выявления FRB, CD68 и CD3 выражение. Микроскопический анализ проводился для количественного определения количество положительно окрашенных клеток на 10 выбранных секций высокой мощности поля и их местоположения в стенке артерий.
Воспаление Lymphohistiocytic (ЛГ) в сопровождении гиперплазия интимы и нарушается упругой пластинки был замечен в ЗКО с ничего не найдено в элементах управления. LH инфильтрат состоит из примерно 60% лимфоцитов и 40% макрофагов. FRB выражение ограничивался макрофагов, состоящий из 31% всего населения CD68 + макрофагов и локализованные для средств массовой информации и адвентиции. Не FRB был замечен в элементах управления.
Этот протокол продемонстрировал шаблон различных численных и пространственной FRB макрофага по отношению к сосудистой иммунной микроокружения в ЗКО.
Introduction
Гигантоклеточная артериит (ВКА) является воспалительным заболеванием средне крупных артерий, ориентация аорты и ее ветвей и затрагивает пожилых людей. Она представляет с умеренной до тяжелой ишемических осложнений, таких как головные боли, боли в челюсти, потеря зрения, инсульта и тканей гангрены. Диагноз подтверждается высоким воспалительные маркеры как скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и собственный гистопатологические картины на височной артерии биопсии (вкладка)1. ГКА является наиболее распространенным взрослых васкулит, и доступность височной артерии, полученные для диагностики представляет преимущество над другими специализирующемуся, таким образом позволяя один для изучения его патогенез более легко. Типичные результаты на закладке включают инфильтрата гистиоциты/макрофагов и Т-лимфоцитов, нашли на всех уровнях сосудистой интимы туника, СМИ и адвентиции с параллельной разрушения упругой пластинки, которая обычно отделяет эти 2отсеках. Текущий доказательства свидетельствуют, что ВКА включает неизвестный антиген, который активирует дендритные клетки в адвентиции сосудов, следуют найма помощника клетки T (Th), специально Th1 и Th17 подтипы, которые выделяют интерлейкина-17 и Интерферон гамма (МГС) соответственно. ИФГ затем новобранцев и активирует макрофаги производить цитокинов и протеаз. К ним относятся провоспалительных цитокинов; включая Ил-12, которая взаимно активирует клетки Th1, обеспечивая тем самым положительной обратной связью; фактор некроза опухоли и интерлейкина-6, вызывающие артрит и металлопротеаз и лихорадки, которые повреждают упругой пластинки. Глюкокортикоидов (GC), которые являются стандартной терапии хронической, частично управлять цитокина пути ослабления Th17/Ил-17, но не Th1/IFG руку иммунный ответ3,4. К сожалению прекращение GC приводит к рецидиву болезни. В качестве альтернативного механизма метотрексат был многоцелевых ГЦА лечения, но желаемого клинические конечные точки не были достигнуты последовательно, хотя более чувствительных биомаркеров не были использованы для терапевтического мониторинга5,6 . В 2017 году интерлейкин 6 окон, tocilizumab, был одобрен для лечения вка, как доказано эффективно болезнями и стероидных щадящие эффекты7,8.
На сегодняшний день, есть нет хороших biomarkers для ЗКО. В результате трудно контролировать активность заболевания и титровать дозы доступных препаратов, чтобы избежать неблагоприятных последствий и уменьшить бремя расходов для общества. Таким образом важно, чтобы искать кандидата биомаркеров, что коррелирует с активностью болезни, обеспечивают новые идеи по патогенезу и помощи в терапевтических решений.
Dysregulation активация макрофагов является решающим фактором в патогенезе ЗКО. Таким образом могут быть эффективным средством лечения вка, избирательного отношения к Активированные макрофаги. Фолиевая кислота рецепторов бета (FRB) является glycosyl фосфатидилинозитол гликопротеин, которая зиждется на клеточной мембране в нормальной миеломоноцитная клеток, клеток миелоидной лейкемии и активация макрофагов. Его лиганда, фолиевая кислота, является одним из важнейших витаминов в сокращенной форме, которая позволяет клеточной ДНК синтеза, метилирование и ремонт9. FRB выражение индуцируется в аутоиммунных заболеваний и канцерогенеза. Его выражение ограничен поверхности моноциты или про воспалительных M1 макрофагов в ревматоидный артрит, или противовоспалительные м2 макрофагов в твердые органов и миелоидных злокачественных10,11,12 , 13. в дополнение к своей потенциальной роли в качестве биомаркера активированных макрофагов, FRB можно включить селективного наркотиков транспорта через многоступенчатый процесс, который начинается с привязкой рецепторов фолиевой кислоты, антифолаты или фолиевой кислоты конъюгированных наркотиков в ячейке поверхности, следуют интернализации, выпуска и окончательной доставки желаемого наркотиков внутренних ячейки машин12,14,15,16. В отличие от FRB выражена в раковых клеток и активации макрофагов, FRB, выраженные в нормальные гемопоэтические клетки способны связывать фолатов, обеспечивая тем самым, что FRB/фолиевой кислоты опосредованной лекарств ограничен FRB-положительных воспалительных или раковые клетки.
В нашем предыдущем исследовании мы показали в первый раз, что FRB выражается в ЗКО макрофагов и его выражение коррелирует с CD68 + и эндотелина рецептора бета макрофаги, которые способствуют ГЦА патогенеза17. В настоящем докладе мы описываем гистопатологические и Иммуногистохимические методы используются для оценки FRB макрофагов и анализируется общая лимфоцитов и макрофагов рассчитывает получить представление о FRB позиции в ЗКО сосудистой ландшафт.
Protocol
Representative Results
Discussion
ГКА является наиболее распространенным васкулит у взрослых, и его патологического hallmark является примером мощное сочетание вспомогательные Т-лимфоцитов и активации макрофагов, которые также могут быть найдены в других гранулематозный заболевания или специализирующемуся как саркоид?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа стала возможной благодаря поддержке д-р Дуглас лестницы, Марианна Klinger, Энн Бенко, Отдел ревматологии/Департамента медицины и молекулярной и гистопатологические Core лаборатории, Пенн государственного университета колледж медицины, Херши PA.
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. . Primer on the rheumatic diseases. , (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis. New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Recherche en cancérologie. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis – a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. . Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. . Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A., Fratzl, P. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
