Un estudio de Immunohistopathologic a perfil el folato del Receptor Beta macrófago y microambiente inmunológico Vascular en Arteritis de células gigantes
Summary
El protocolo muestra el uso de la examinación histopatológica e inmunohistoquímica al perfil el macrófago de beta del receptor de folato y su relación con el total de la célula inmune infiltran en las biopsias de arteria temporal en la arteritis de células gigantes.
Abstract
Arteritis de células gigantes (ACG) es una mediada inmune enfermedad crónica de las arterias de tamaño mediano a grande que afecta a los adultos mayores. GCA se manifiesta con síntomas oclusivos de dolores de cabeza y artritis, movimiento o pérdida de la visión. Linfocitos T-helper y macrófagos infiltran la pared vascular y producen una respuesta pro-inflamatorias que conducen a daño a los vasos e isquemia. Hasta la fecha, no hay ningún biomarcador GCA que puede monitorear la respuesta terapéutica guía y actividad de la enfermedad.
Beta del receptor de folato (FRB) es una proteína glicosilfosfatidilinositol anclada en las membranas celulares y normalmente se expresa en la estirpe mielomonocítica y en la mayoría de las células de la leucemia mieloide, así como en el tumor y los macrófagos sinoviales reumatoides, donde su expresión se correlaciona con la severidad de la enfermedad. La capacidad de FRB compuestos de ácido fólico, ácido fólico-conjugados y fármacos antifolatos ha hecho un blanco druggable en cáncer y la investigación de la enfermedad inflamatoria. Este informe describe los métodos histopatológicos e immunohistochemical para evaluar la expresión y distribución de FRB en lo referente a GCAimmunopathology.
Las biopsias de arteria temporal fijados con formol y embebido en parafina de ACG y controles normales fueron teñidas con hematoxilina y eosina para revisar la histología del tejido e identificar características patognomónicas. Immunohistochemistry fue utilizado para detectar expresión de FRB, CD68 y CD3. Se realizó un análisis microscópico para cuantificar el número de células teñidas positivamente en 10 secciones de campo de alta potencia seleccionadas y sus respectivas ubicaciones en la pared arterial.
Inflamación lymphohistiocytic (LH) acompañada de hiperplasia intimal y lámina elástica interrumpido fue visto en GCA con ninguno en los controles. El infiltrado de LH fue compuesto de aproximadamente 60% linfocitos y 40% macrófagos. Expresión de FRB se restringió a los macrófagos, que comprende el 31% de la población de macrófagos CD68 + total y localizada a la media y adventicia. No FRB se observó en los controles.
Este protocolo demostró un patrón numérico y espacial distinto del macrófago FRB en relación con el microambiente inmunológico vascular en ACG.
Introduction
Arteritis de células gigantes (ACG) es una enfermedad inflamatoria de las arterias medianas a grandes, dirigidos a la aorta y sus ramas y que afectan a los adultos mayores. Presenta leves a severas complicaciones isquémicas tales como dolores de cabeza, dolor de mandíbula, pérdida de la visión, movimiento y tejidos gangrena. La diagnosis es confirmada por altos marcadores inflamatorios como tarifa de sedimentación de eritrocito (ESR) y un patrón histopatológico distinto en la biopsia (ficha) de arteria temporal1. GCA es la vasculitis más común de adultos, y la accesibilidad de la arteria temporal obtenida para diagnóstico presenta una ventaja sobre otros vasculopathies, así que permiten estudiar más fácilmente su patogenesia. Los resultados típicos en ficha incluyen un infiltrado de macrófagos/histiocitos y linfocitos T encontrados todas las capas vasculares de la intima del tunica, media y adventicia con simultánea destrucción de la lámina elástica que normalmente separa estos compartimientos de2. La evidencia actual demuestra que GCA implica un antígeno desconocido que activa las células dendríticas en la adventicia vascular, seguido por la contratación de ayudante células de T (Th), subtipos específicamente Th1 y Th17 que secretan interleucina-17 y interferón-gamma (IFG) respectivamente. IFG y recluta y activa los macrófagos para producir citocinas y proteasas. Estos incluyen las citoquinas pro inflamatorias; incluyendo la IL-12, que recíprocamente activa Th1 células proporcionando así un bucle de retroalimentación positiva; factor de necrosis tumoral y la interleucina-6, que causa la artritis y fiebres y metaloproteasas que dañan la lámina elástica. Glucocorticoides (GC), que constituyen la terapia crónica estándar, controlan parcialmente las vías del cytokine atenuando la Th17/IL-17, pero no el brazo Th1/IFG de la respuesta inmune3,4. Desafortunadamente, discontinuación de la GC resulta en recaída de la enfermedad. Como una modalidad alternativa, metotrexato ha sido repurposed para el tratamiento de la GCA y los puntos finales clínicos deseados no siempre lograron aunque biomarcadores más sensibles no han sido utilizados para el monitoreo terapéutico5,6 . En 2017, el bloqueador de interleucina 6, tocilizumab, era aprobado para el tratamiento de ACG como demostró con eficacia control de la enfermedad y esteroides sparing efectos7,8.
Hasta la fecha, no hay ninguna buena biomarcadores para GCA. Como resultado, es difícil supervisar actividad de la enfermedad y valorar la dosis de fármacos disponibles para evitar los efectos adversos y reducir la carga de costo a la sociedad. Por lo tanto, es imperativo buscar un biomarcador de candidato que se correlaciona con la actividad de la enfermedad, proporcionar nuevos conocimientos sobre patogénesis y ayuda en las decisiones terapéuticas.
La desregulación de la activación de los macrófagos es un factor crítico en la patogénesis de la GCA. Así, puede ser un medio eficaz de tratar la GCA la focalización selectiva de macrófagos activados. La beta del receptor del folato (FRB) es una glicoproteína de glicosil-fosfatidilinositol que está anclada en la membrana de la célula expresados en células myelomonocytic normal, las células de la leucemia mieloide y activa los macrófagos. Su ligando, el ácido fólico es una vitamina esencial en su forma reducida, que permite que celular DNA síntesis, reparación y metilación del9. FRB expresión es inducida en la enfermedad autoinmune y durante la carcinogénesis. Su expresión se limita a la superficie de monocitos o macrófagos pro-inflamatorias de M1 en la artritis reumatoide o a antiinflamatorios macrófagos M2 en órganos sólidos y malignidades mieloides10,11,12 , 13. Además de su papel potencial como un biomarcador de macrófagos activados, la unidad FRB puede habilitar el transporte de droga selectiva a través de un proceso de múltiples paso que comienza con el atascamiento del receptor para ácido fólico, antifolates o medicamentos conjugados con ácido fólico en la célula superficie, seguida de la internalización, la liberación y la eventual entrega de droga deseada a la interna de la célula maquinaria12,14,15,16. En contraste con FRB expresado en las células cancerosas y activa macrófagos, FRB expresado en las células hematopoyéticas normales es incapaz de enlazar folatos garantizando que FRB/folato-mediado entrega de la droga se limita a FRB-positiva inflamatoria o las células cancerosas.
En nuestro estudio anterior, demostramos por primera vez que FRB se expresa en los macrófagos de la GCA y su expresión correlaciona con CD68 + y endotelina macrófagos de receptores beta, que contribuyen a la patogénesis de GCA17. En este informe, describimos el histopatológico y métodos inmunohistoquímicos utilizan para evaluar el macrófago de la FRB y analizan el total de linfocitos y macrófagos cuenta para ganar la penetración en la posición de la FRB en el paisaje vascular GCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
GCA es la vasculitis más común en adultos, y su seña de identidad patológica ejemplifica una potente combinación de linfocitos del ayudante T y activa los macrófagos que se encuentran también en otras enfermedades granulomatosas o vasculopathies como sarcoidosis y polyangiitis granulomatosa2,3. En ACG, la arteria temporal proporciona una buena representación de una arteria de tamaño mediano a grande y la biopsia TA da una muestra de tamaño considerable …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue posible gracias al apoyo del Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, la división de Reumatología del Departamento de medicina y la Molecular y laboratorio de base histopatológica, Penn estado Colegio de medicina de la Universidad, Hershey PA
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. . Primer on the rheumatic diseases. , (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis. New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Recherche en cancérologie. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis – a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. . Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. . Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A., Fratzl, P. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
