Detta är ett protokoll för att isolera vävnad extracellulära vesikler (EVs) från levern. Protokollet beskriver en tvåstegsprocess som inbegriper kollagenasper fusion följt av differential ultracentrifugering för att isolera levervävnad EVS.
Extracellulära blåsor (EVs) kan släppas från många olika celltyper och detekteras i de flesta, om inte alla, kroppsvätskor. EVs kan delta i cell-till-cellkommunikation genom shuttling bioaktiva molekyler såsom RNA eller protein från en cell till en annan. De flesta studier av EVs har utförts i cellkultur modeller eller i EVs isolerade från kroppsvätskor. Det finns ett växande intresse för isolering av EVs från vävnader för att studera deras bidrag till fysiologiska processer och hur de förändras i sjukdom. Isoleringen av EVs med tillräcklig avkastning från vävnader är tekniskt utmanande på grund av behovet av vävnads dissociation utan cellulära skador. Denna metod beskriver ett förfarande för isolering av EVs från mus levervävnad. Metoden omfattar en tvåstegsprocess som inleds med in situ -kollagenasnedbrytning följt av differential Ultra-centrifugering. Vävnad perfusion med hjälp av kollagenase ger en fördel framför mekanisk skärning eller homogenisering av levervävnad på grund av dess ökade avkastningen av erhållna EVs. Användningen av denna tvåstegsprocess för att isolera EVs från levern kommer att vara användbart för studier av vävnad EVs.
Extracellulära blåsor (EVs) är membran-bundna blåsor som frigörs från många olika typer av celler i kroppen. EVs innehåller en last av molekyler som inkluderar RNA, DNA, och protein. Överföring av denna last av EVS från en cell till en annan är postulerade som en mekanism genom vilken celler i vävnader kommunicerar med varandra1. Merparten av information om lasten eller rollerna av EVs vid normal hälsa och sjukdom har hämtats från studier av EVs som erhållits från celler i kultur eller samlats in från cirkulationen eller andra kroppsvätskor2. För att förstå deras fysiologiska roller in vivoär en robust metod nödvändig för isolering av vävnadevs som fångar alla populationer av EVS och undviker cellulära skador eller kontaminering3. Det övergripande målet för den metod som beskrivs häri är att isolera vävnad EVs från mus lever.
De flesta celltyper i levern har visat sig producera EVs, och studiet av EV-baserade signalering är att främja grundläggande kunskap och förståelse för leversjukdomar. Den kombinerade effekten av EVs från olika celltyper inom vävnader är dock endast delvis förstådd. Isolering av EVs från levervävnad är nödvändig för att förstå in situ -bidragen från EVS inom vävnads miljön. Den metod som beskrivs häri är baserad på en två-stegs perfusion för att förbättra vävnads dissociation och minimera cellskador. Därefter isoleras EVs från den separerade lever vävnaden. Metoder med två-stegs perfusion för isolering av hepatocyter har använts sedan början av 1950-talet4. Dessa metoder för hepatocyte isolering har modifierats och kontinuerligt förbättrats och är nu standardmetoder för isolering av hepatocyter i kulturer, i cellsuspensioner, och från vävnader5,6,7. I det första steget, levern utsätts för en icke-recirkulerande perfusion med kalcium-fri buffert, Hank ‘ s balanserade saltlösning (HBSS). I det andra steget, levern är parfymerad med kollagenase att lösa upp den extracellulära matrisen för ytterligare separation av desmosomal cell-till-cell korsningar. En optimal behandlingstid för upplösning av kollagenase är 7 till 10 minuter. En kortare behandlingstid kommer att orsaka ofullständig upplösning och behålla Cellkontakter i levern, medan en längre varaktighet kan orsaka leverskador eller Portal ven störningar. EVs isoleras sedan med differentialcentrifugering för att avlägsna celler och cellulär skräp. Detta resulterar i EV insamling i hög avkastning som kan användas för ytterligare nedströms analyser eller studier.
Detta protokoll beskriver en optimal och reproducerbar metod för isolering av levervävnad EV med hjälp av en två-stegs perfusion process via portalen ven följt av differentiell ultracentrifugation. Viktiga steg i förfarandet inkluderar kanyl placering, kollagenas koncentration och digestionstid, flödeshastighet av mediet, hantering av vävnaden efter matsmältningen, och klassisk differential ultracentrifugation.
Cell separation uppnås genom separation från bindvävs komponenter efter nedbrytning med kollagenas typ IV. Koncentrationen av kollagenas som används för perfusion kan variera från 0,1 till 5 mg/mL. Det kan finnas betydande sats-till-sats variation i effekten av kollagenase för vävnadsnedbrytning. Koncentrationerna av kollagenas från 0,5 till 5 mg/mL testades, men den koncentration som användes hade inte någon större inverkan på avkastningen av erhållna EVs. Med hjälp av en högre koncentration av kollagenase kommer att resultera i en snabbare svullnad och blekning av levern. Målet är att uppnå tillfredsställande cell dissociation utan överdriven kontaminering eller skador. En optimal koncentration av kollagenas som används i dessa isoleringar är 1-2 mg/ml perfunderade för 7-8 min med en flödeshastighet på 8 ml/min. En perfusion förfarande som är för lång kommer att öka risken för att förstöra den tunna bindväv i levern samt öka tekniska risker såsom nål dislodgment från portalen ven eller luft svällning med venen.
Den mest utmanande aspekten av detta protokoll är kanyleringen av portalen ven. Detta kan vara utmanande att utföra, särskilt i möss i 18-till 25-g storleksintervall. Teknikerna för kollagenas perfusion utvecklades ursprungligen för användning hos råttor och antogs därefter för användning på möss efter många modifieringar och justeringar. Kanylering med hjälp av en 23G blod samling set är lättare än placeringen av en kateter i blodkärlen i liten luminala diameter. Fastställande av kanyl med hjälp av tråd med en propp Knut rekommenderas för att undvika fördrivning och knuten fungerar också som en markör för portalen ven plats i fall kanyl lossnar fartyget.
För nedströms analys är det oerhört viktigt att ha minimal kontaminering från celler. Det finns flera viktiga överväganden i hanteringen av vävnad efter matsmältningen. Först, pinkoppar och sax ändras när levern extraheras för att undvika blod förorening. För det andra är det viktigt att gallblåsan försiktigt avlägsnas från levern för att undvika att riva och oönskad kontaminering från galla. Tredje, när levern har tagits bort från musen, levern tvättas mycket försiktigt med PBS att ta bort blod. Minimering av kontaminering med celler bör ges högre prioritet än minskning av avkastningen för erhållna EVs.
Ultracentrifugation är den mest använda metoden för isolering och rening av EVS8,9,10,11. Denna metod kommer att ta bort de flesta parenkymala celler såsom hepatocyter eller cholangiocyter och icke-parenkymala celler såsom Kupffer celler, sinusformade endotelceller, och stellate celler, dessutom kommer cellfragment, cell aggregeringar och döda celler också att avlägsnas genom differential centrifugering. Ytterligare rening och isolering av specifika populationer kan utföras av storleks uteslutnings kromatografi för att avlägsna alla icke-vesikulär protein aggregat eller lipoproteiner.
En begränsning av detta protokoll är att den inte kan fånga alla vävnads blåsor, med tanke på möjligheten att vissa blåsor kan avlägsnas i parfymen. Om en helhetsbedömning behövs, bör insamling av parfymen och isolering av vesikler inom parfymen övervägas. En ytterligare begränsning är potentialen för cellskador. För att övervaka den potentiella effekten av överdriven celldöd, kan cellernas lönsamhet övervakas och införlivas i kvalitetsparametrar för vävnads-EV-isoleringar. Sammanfattningsvis beskriver detta förfarande ett optimerat arbetsflöde med hjälp av en två-stegs perfusion teknik via portalen ven följt av differentiell ultracentrifugering för att få levervävnad EVS från mus lever vid en hög avkastning. Dessa vävnad EVs är lämpliga för nedströms analyser såsom karakterisering av Biomolekylär sammansättning och andra studier som syftar till att karakterisera deras fysiologiska eller patofysiologiska roller eller potentiella tillämpningar som sjukdomsmarkörer.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av finansiering från National Cancer Institute Grant CA-217833.
125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
Curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Masking tape | Home supply store | ||
Aluminum foil | Home supply store | ||
Styrofoam pad | Home supply store | ||
Absorbent Bench Underpad | Scientific inc. | B1623 | |
Masterflex L/S Digital Miniflex Pump | Cole-parmer | ZX-07525-20 | |
Water bath | Thermo Electron Precision | 2837 | |
Blood collection sets | Becton Dickinson | 367292 | |
Petri dish, clear lid 100×15 | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Falcon 70mm Nylon Cell Strainers | Fisher scientific | 352350 | |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
Cotton Tipped Applicators | Moore medical | 69622 | |
25mL Serological Pipet | Falcon | 357525 | |
Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser | BioSurplus | 203-2751 | |
O2 gas | |||
Isoflurane | |||
Levo Plus Motorized Pipette Filler | Scilogex | 74020002 | |
Centrifuge 5804R | Sigma-aldrich | 22628048 | |
Beckman Coulter Optima L-100 XP | Beckman | 969347 | |
Beckman Coulter Avanti JXN-26 | Beckman | B34182 | |
70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman | 337922 | |
JA-25.50Fixed-Angle Rotor | Beckman | 363055 | |
Nalgene Round-bottom tube | Thermo Scientific | 3118-0028 | |
Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly | Beckman | 355618 | |
Reagents | |||
HyClone Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free | Fisher scientific | SH30588.01 | |
Collagenase, Type IV, powder | Fisher scientific | 17104019 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher scientific | SH30256.01 |