肝臓からの組織外細胞小胞の分離

動物を含むすべての研究は、メイヨークリニック機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。 1. ベンチの準備 水風呂を準備し、37 °Cに設定します。その他の必要な機器とセットアップを図1に示します。 100mgのコラゲナーゼ型IVを測定し、水浴中のHBSSの100 mLを含む125mLフラスコ(40°C)に加えます。フラスコの液体を旋回してコラゲナセが溶解していることを確認し、フラスコが水浴中に完全に沈んでいることを確認します。効率を上げるために、コラゲナーゼが瞬時に溶解しているように見えても、少なくとも30分間溶解できるようにします。 40°Cの水浴にHBSSの50 mLを含む125 mLフラスコを水没します。これは、初期フラッシュに使用されます。 70%のエタノールでハサミや鉗子などのすべての機器の表面をスプレーします。いくつかのきれいな綿棒を準備します。 ポンプを通して70%エタノールを動かしてポンプのチューブをすすいで、流水で2回すすいで残留エタノールを取り除きます。 ラボベンチに吸収性ベンチパッドを置き、ハードボックス容器を上に置きます。これは、マウス灌流中に余分な液体を含むために必要になります。ポリスチレンフォームパッドをアルミホイルで包み、容器の中に入れます。 ベンチの近くに無菌10cmの培養皿を置きます。これは、灌流が完了した後、消化された肝臓を保持するために使用されます. あらかじめ無菌培養皿にコラゲナーゼ培地(ステップ1.2)を10mL注ぎます。 翼付き採血セットを使用して、23ゲージをポンプチューブの自由端に接続します(蝶カニューレから翼を切り取ることで、より良い取り扱いにつながります)。採血のカニューレの先端が満たされるまで渡します。 2. 動物の準備 イソファルランを使用して麻酔を開始する前に、十分な量の供給ガスが手順の間利用可能であることを確認してください。1-2 Lで誘導室への酸素(O2)供給をオンにし、流量計を使用して2〜4%の間でイソファランをオンにします。 誘導室にマウスを入れ、上部のドアを閉じます。マウスがリカンベントになるまで監視します。注:チャンバー内のガスは、マウスを数分間麻酔状態に保ちます。 アルミホイルで包まれたポリスチレンフォームパッドの上にマウスを置きます。誘導室からノセコーンへの流れを切り替えます。麻酔が十分であることを確認してください。マウスが反応し始めた場合は、完全に麻酔が整うまで、鼻コーンで軽く拘束します。 手順中に呼吸と刺激に対する応答を監視することにより、麻酔を確保します。適切な麻酔を確保するために、必要に応じてレートフローメーターを調整します。足は麻酔下のピンチテストに反応しなでなければならない。追加の詳細は、動物の世話のための実験室ガイドから得られるかもしれません。 マウスの 4 本の四肢すべてをテープまたはピン留めします。 70%のエタノールをスプレーし、ガーゼとアルコールパッドで拭き取ることによって、腹部の上に皮膚をきれいにします。この手順は、マウスファーからの汚染を避けるために重要です。 生殖不能のはさみを使用して、前部から骨盤の骨まで皮膚を広く開いたカットを行います。内臓を切らないのは注意が必要です。綿の先端のアプリケーターを使用して、入門静脈(PV)と劣った静脈カバ(IVC)を静かに露出させ、動物の左側に腸を置き換えます。 3. カネレーションと灌流(0.5時間) 湾曲した鉗子を使用して、ポータル静脈の下に糸を置き、結び目をゆるく結び、カナンテーション後にしっかりとチンチングを準備します。 カニューレ(採血セットから23G)を合字の下5~10mmのポータル静脈に挿入します。最初のポータルブランチを過ぎてカニューレを挿入しないでください。カニューレはストッパーの結び目を使用して糸で固定または固定することができる。 低流量(1-2 mL/min)でHBSSに注入するポンプを開始します。カンヌレーションが成功することが確認されると、肝臓はブランチを開始します。 IVCをカットして圧力を和らげ、肝臓内の過剰な流体を排出できるようにします。これは、カニューレが移動しないように、他の手で演算子を使用して行うのが最適です。 ゆっくりと流量を8 mL/minに増加させ、次の5分にわたって肝臓を通してHBSSの全体の50 mL容積を使用して灌流を完了する。 HBSSが不足し始める直前に、培地を含むコラゲナーゼ(ステップ1.2)をビーカーに変更します。気泡が存在しないことを確認し、媒体を変更するときに肝臓に流れ込まないようにしてください。 鉗子で締め金で止めることで、5秒間隔でIVCに過渡圧力を加えます。これは、肝臓が膨らみ、組織の消化と解離(7-8分)を助ける原因となります。消化が進むにつれて、肝臓は膨らみ、白くなる。肝臓は、元のサイズの約2倍に均一に膨れ上がることができます。 ポンプをオフにし、消化が完了したらカニューレを取り除きます。肝臓の消化の完了は、マウスのサイズと肝臓の状態に依存します。綿の先端のアプリケーターを使用して肝臓を穏やかに調べている場合、肝臓のへこみが観察されます。 胆嚢を肝臓から取り除き、引き裂かないように注意してください。洗ったはさみと鉗子を使って、マウスから肝臓をリン酸緩衝生理食(PBS)を含む無菌10cm培養皿に抽出し、表面洗浄を行います。肝臓をコラーゲナーゼ培地を含む無菌10cm培養皿に慎重に移す(ステップ1.8から)。これは、マウスの血液と胆汁からの汚染を避けるための重要なステップです。 肝臓から細胞を穏やかに振りながら、2つのきれいな鉗子で肝臓をつかんで引き裂きます。この場合、メディアは曇ります。すべての肝細胞は、結合組織と血管組織を残して、離れて振ることができます。 肝臓の未消化部分が振り落とされるまで、3 mL注射器を使用して細胞溶液を何度もトリチュレートします。70 μmのナイロン細胞ストレーナーを備えた50 mL円錐管に注ぎ、未消化結合組織を濾過します。残りの細胞を収集し、50 mL円錐形のチューブを埋めるためにHBSSで皿を洗います。 50 mLの円錐形チューブを50×gで50×10分間、4°Cで10分間静かに遠心分離します。 上清を新しい50 mL円錐管に移します。 4. EVの分離(5時間) 上清を300xgで遠心分離し、4°Cで10分間使用します。 上清を新しい50 mL円錐形チューブに移します。 上清を2000xgで20分間4°Cで遠心分離し、細胞の破片や凝集体を除去します。 上清を丸底管に移し、上清を10,000 x gで4°Cで70分間遠心分離します。 上清を回収し、4°Cで70分間100,000 x gでポリカーボネート超遠心管と遠心分離機に入れます。 その後、PBSで再中断することによって洗浄される超遠心管にペレットを収集します。上清をさらに100,000 x gで遠心分離し、4°Cで70分間使用します。 細胞ナノベシクルからなる最終ペレットは、実験に直接使用したり、1000μLのPBSで再懸濁したり、-80°Cで保存することができます。 5. 分離の質と収率の評価 ナノ粒子トラッキング解析または計測器メーカーのプロトコルに従って抵抗パルス検出を行うサイズ分布と濃度を評価します。 特定の実験ニーズに基づいて、ショ糖勾配またはクッションの添加、免疫親和性技術、またはサイズ排除クロマトグラフィーなどの様々なアプローチによって、特定の小胞集団のさらなる分離および精製を行う。