בידוד של מסחטות ושלפוחיות רקמה מהכבד

כל המחקרים הכרוכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של מאיו מרפאת ושימוש. 1. הכנת ספסל הכן מרחץ מים והגדר אותו ל-37 ° c. הציוד וההגדרה האחרים הנחוצים מוצגים באיור 1. למדוד 100 מ”ג של הקולגן מסוג IV ולהוסיף אותו בקבוקון 125 mL המכיל 100 mL של HBSS באמבט מים (40 ° c). ודא כי הקולגן הומס כבר התפרקה על ידי מתערבל את הנוזל בבקבוקון, וגם לוודא כי הבקבוקון מתחת למים לחלוטין באמבטיה. ליעילות רבה יותר, לאפשר את הקולגן כדי לפזר לפחות 30 דקות למרות שהוא עשוי להיראות להתמוסס באופן מיידי. לטבול בקבוקון 125 mL המכיל 50 mL של HBSS באמבט מים ב 40 ° c. זה ישמש עבור השטיפה הראשונית. רסס את פני השטח של כל המכשירים כגון מספריים מלקחיים עם 70% אתנול. הכינו כמה מטליות כותנה נקיות. לשטוף את אבובים של המשאבה על ידי הפעלת 70% אתנול דרך המשאבה ולהסיר כל אתנול שיורית על ידי שטיפה אותו פעמיים עם מים זורמים. הניחו משטח ספסל סופג על ספסל המעבדה והניחו מכולה בקופסה קשה למעלה. זה יהיה צורך להכיל כל הנוזלים עודף במהלך perfusion העכבר. עוטפים משטח פוליסטירן מוקצף עם רדיד אלומיניום ומניחים אותו בתוך המיכל. מניחים צלחת תרבותית 10 ס מ קרוב הספסל. זה ישמש להחזיק את הכבד מתעכל לאחר זלוף הושלמה. יוצקים 10 מ ל של קולגן בינוני (שלב 1.2) לתוך תבשיל תרבות סטרילית מראש. באמצעות ערכת איסוף דם כנפיים, לחבר את 23 מד לקצה החופשי של צינורות המשאבה (חיתוך כנפיים מתוך צינורית פרפר יכול להוביל לטיפול טוב יותר). לעבור עד קצה הצינורית של איסוף הדם מתמלא. 2. הכנה לבעלי חיים לפני תחילת ההרדמה באמצעות isofלאנה, ודא שכמות מספקת של גז האספקה זמינה למשך ההליך. הפעל את החמצן (O2) לחדר אינדוקציה ב 1-2 L, ואז להפעיל את isof, בין 2-4% באמצעות flowmeter. הכניסו את העכבר לחדר האינדוקציה וסגרו את הדלת העליונה. נטר את העכבר עד שהוא שכיבה.הערה: הגזים בחדר ישמור על העכברים מורדם למשך מספר דקות. מניחים את העכבר על משטח קצף קלקר עטוף ברדיד אלומיניום. . העבר את הזרם מחדר האינדוקציה לנוס1 . תוודא שההרדמה מספיקה אם העכבר התחיל להגיב, בעדינות לרסן אותו בקונוס אף עד שהוא מורדם לחלוטין. להבטיח הרדמה על ידי ניטור נשימה ותגובה גירוי במהלך ההליך. התאימו את הקצב flowmeter לפי הצורך כדי להבטיח הרדמה נאותה. כפות הרגליים בטח לא מגיבות. לבדיקת הצביטה בהרדמה פרטים נוספים ניתן לקבל ממדריך המעבדה לטיפול בבעלי חיים. קלטת או להצמיד את כל ארבעת הגפיים של העכבר. נקה את העור על הבטן על ידי ריסוס עם 70% אתנול וניגוב אותו עם גזה וכרית אלכוהול. שלב זה הוא קריטי כדי למנוע זיהום מפרוות העכבר. לעשות חתך רחב לחתוך דרך העור מן הקדמי אל עצם האגן באמצעות סט של מספריים סטרילי. היזהרו לא לחתוך איברים פנימיים. הגבר את המעיים לצד שמאל של בעל החיים באמצעות כותנה משופעת בעדינות כדי לחשוף את הווריד הפורטל (PV) והוריד הנחות (IVC). 3. צינורית ופרזיה (0.5 h) שימוש מלקחיים מעוקל, המקום חוט מתחת לווריד השער ולקשור קשר באופן רופף כדי להכין הדוק לאחר הצינורית. הכנס את הצינורית (23G מערכת איסוף הדם) לתוך הווריד השער 5-10 מ”מ מתחת לקשירה. אין להכניס את הצינורית לעבר ענף הפורטל הראשון, אחרת האונה הקדמית הימנית יכולה להיות מספקת. הצינורית יכולה להיות קבועה או מהודקת עם פתיל באמצעות קשר פקק. הפעל את המשאבה כדי להחדיר HBSS בקצב הזרימה נמוכה (1-2 mL/min). ברגע שהצינורית תאשר. שתצליח, הכבד יתחיל להתנחל חותכים את ה-IVC כדי להקל על הלחץ ולאפשר נוזלים מוגזמת בתוך הכבד כדי לנקז. הדבר הטוב ביותר נעשה באמצעות מפעילי היד האחרת כך שהצינורית לא תועבר. לאט להגדיל את קצב הזרימה של 8 mL/min ולהשלים את הפרפיוז באמצעות הנפח כולו 50 mL של HBSS דרך הכבד, במהלך 5 דקות הבאות. לשנות את הקולגן המכיל בינוני (שלב 1.2) לתוך הגביע ממש לפני HBSS מתחיל לרוץ החוצה. ודא כי בועות אוויר אינם נוכחים ולא לזרום לתוך הכבד בעת שינוי המדיום. החל לחץ ארעי על ה-IVC במרווחי זמן של 5 על ידי העצמה עם מלקחיים. זה יגרום לכבד להתנפח ולעזור עם עיכול והדיסוציאציה של רקמות (7-8 דקות). ככל שעיכול מתקדם, הכבד יהיה מתנפח והופך לבן. הכבד יכול להתנפח בצורה אחידה כפליים מגודלה המקורי. כבו את המשאבה והסירו את הצינורית לאחר השלמת העיכול. השלמת עיכול הכבד יהיה תלוי בגודל של העכבר והמצב של הכבד. שקע בכבד ניתן להבחין אם המוליך משופעת כותנה משמש כדי לחקור בעדינות את הכבד. , להסיר את כיס המרה מהכבד. להיזהר לא לקרוע אותו באמצעות זוג שטוף של מספריים ומלקחיים, לחלץ את הכבד מהעכבר לתוך מאכל מעוקר 10 ס מ המכיל מלוחים פוספט באגירה (PBS) עבור שטיפת פני השטח. העבר את הכבד בזהירות לתוך המנה סטרילי 10 ס מ תרבות המכילה קולגן בינוני (משלב 1.8). זהו צעד קריטי עבור הימנעות זיהום דם העכבר מרה. לתפוס ולקרוע את הכבד עם שני מלקחיים נקיים תוך לטלטל בעדינות את התאים מהכבד. כשזה יקרה, המדיום. יהיה מעורפל כל הפטוציטים יכולים להיות מזועזעת, להשאיר מאחורי רקמת החיבור ורקמת כלי הדם. Triturate פתרון התאים פעמים רבות באמצעות מזרק 3 מ ל עד החלקים הבלתי מתעכל של הכבד מזועזעת. יוצקים את זה לתוך שפופרת 50 mL עם 70 מיקרומטר תא ניילון לסנן כל רקמת חיבור שלא מתעכל. לשטוף את הצלחת עם HBSS לאסוף את התאים הנותרים ולמלא את הצינור 50 mL חרוט. צנטריפוגה בעדינות את צינור 50 mL ברוטור דלי מנופף ב 50 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטנט לשפופרת חרוט חדשה 50 mL. 4. בידוד של EVs (5 שעות) צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-300 x g במשך 10 דקות ב -4 ° c. העבר את הסופרנטנט לתוך צינורית חרוט 50 mL חדשה. צנטריפוגה את supernatant ב 2000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° צ’ כדי להסיר פסולת תא ואגרגטים. העבר את הסופרנטאנט לצינור התחתון עגול ולצנטריפוגה את supernatant ב 10,000 x g עבור 70 דקות ב 4 ° c. לאסוף את supernatant ואת המקום לתוך שפופרת פוליקרבונט ultracentrifuge ו צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 70 דקות ב 4 ° c. לאסוף את הגלולה בצינור ultracentrifuge אשר נשטף אז על ידי השעיית מחדש ב-PBS. צנטריפוגה את הסופרנטנט עוד ב 100,000 x g עבור 70 דקות ב -4 ° c. הגלולה האחרונה המורכבת של ננו שלפוחית תאית ניתן להשתמש ישירות עבור ניסויים או מחדש מושעה עם 1000 μL של PBS ומאוחסן ב-80 ° c. 5. הערכת איכות ותשואה של בדלציות העריכו את התפלגות הגודל והריכוז באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיק או הדופק התנגדות מסוגל חישה לאחר הפרוטוקולים של יצרן המכשיר. ביצוע בידוד נוסף וטיהור של אוכלוסיות שלפוחית מיוחדות בגישות שונות כגון תוספת של מעבר שיפוע או כרית, טכניקות של זיקה חיסונית או כרומטוגרפיה של החרגת מהגודל, בהתבסס על צרכים ניסיוניים ספציפיים.