Summary

Inducción de la diferenciación endotelial en las células cardiacas progenitoras en suero bajo condiciones

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Este protocolo describe una técnica de diferenciación endotelial de las células progenitoras cardíacas. Se centra especialmente en cómo la concentración del suero y la densidad de siembra de células afectan el potencial de diferenciación endotelial.

Abstract

Las células progenitoras cardíacas (CPCs) pueden tener potencial terapéutico para la regeneración cardiaca después de la lesión. En el corazón mamífero adultos, CPCs intrínsecos son muy escasos, pero CPCs ampliadas podrían ser útiles para la terapia celular. Un requisito previo para su uso es su capacidad para distinguir de forma controlada en los diferentes linajes cardiacos utilizando protocolos definidos y eficientes. Además, en vitro expansión, CPCs aislaron de pacientes o modelos preclínicos de la enfermedad pueden ofrecer herramientas de investigación fructífero para la investigación de los mecanismos de la enfermedad.

Los estudios actuales utilizan diferentes marcadores para identificar CPCs. Sin embargo, no todos se expresan en los seres humanos, que limita el impacto traslacional de algunos estudios preclínicos. Protocolos de diferenciación que son aplicables independientemente de la expresión de la técnica y el marcador de aislamiento permitirá la expansión estandarizada y cebado de CPCs para propósito de la terapia celular. Aquí describimos que el cebado de CPC bajo condiciones de densidad celular baja y una concentración baja del suero bovino fetal (FBS) facilita la diferenciación endotelial de CPCs. utilizando dos subpoblaciones diferentes de ratón y rata CPCs, demostramos que eso laminin es más sustrato adecuado de fibronectina para este propósito bajo el siguiente protocolo: después de cultivo de 2-3 días en medio incluyendo suplementos que mantienen multipotencia y con 3.5% FBS, CPCs son sembradas en laminina en < 60% confluencia y cultivadas en medio sin suplemento con bajas concentraciones de FBS (0.1%) durante 20-24 horas antes de la diferenciación en medio de la diferenciación endotelial. Porque CPCs son una población heterogénea, las concentraciones séricas y tiempos de incubación deba ajustarse dependiendo de las propiedades de la subpoblación de CPC respectiva. Teniendo en cuenta esto, la técnica puede aplicarse a otros tipos de CPC así y proporciona un método útil para investigar el potencial y los mecanismos de diferenciación y cómo se ven afectados por la enfermedad al utilizar CPCs de modelos de la enfermedad respectiva.

Introduction

Estudios recientes apoyan la existencia de las células progenitoras cardíacas residentes (CPC) en el corazón mamífero adulto1,2,3, y CPC podría ser una fuente útil para la terapia de la célula después de lesión cardíaca4, 5. Además, CPCs ampliados pueden proporcionar un modelo fructuoso para la detección de drogas y la investigación de los mecanismos de la enfermedad cuando están aisladas de pacientes con cardiomiopatías raros, o de enfermedad respectiva modelos6,7.

CPCs aislados del corazón adulto poseen/progenitoras celulares características1,2,3,8 como son multipotentes, clonogenic, y tienen la capacidad de auto renovación. Sin embargo, hay muchas poblaciones diferentes (sub) de CPCs exhibir perfiles de diferentes marcadores de superficie, incluyendo, por ejemplo, c-kit, Sca-1 y otros, u obtenido por técnicas de aislamiento diferentes (tabla 1). Varios protocolos de diferenciación y cultura han sido establecidos1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Estos protocolos varían sobre todo con respecto al factor de crecimiento y contenido de suero, que se ajustan según el propósito del cultivo y que pueden conducir a diferencias en los resultados y los resultados, incluyendo la eficiencia de la diferenciación.

Técnicas de aislamiento basadas en marcadores:

CPC puede ser aislado basado en un marcador de superficie específico expresión1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Estudios previos sugieren que c-kit y Sca-1 son los mejores marcadores para aislar residente CPC1,11,14,19,20. Porque ninguno de estos marcadores es realmente específico para CPC, generalmente se aplican combinaciones de marcadores diferentes. Por ejemplo, mientras que los CPCs expresan bajos niveles de c-kit21, c-kit se expresa también por otros tipos celulares, incluyendo células de mástil22, células endoteliales23y de células progenitoras hematopoyéticas24. Un problema adicional es el hecho de que no todos los marcadores se expresan a través de todas las especies. Este es el caso de Sca-1, que expresa en ratón pero no en humanos25. Por lo tanto, utilizando protocolos que son independientes de los marcadores de aislamiento puede ser ventajoso a la vista de los ensayos clínicos y estudios con muestras humanas.

Técnicas de aislamiento independiente del marcador:

Existen varias técnicas importantes de aislamiento de la CPC, que son sobre todo independientes de la expresión superficial del marcador, pero que se puede refinar la selección consecutivos de subfracciones de marcador positivo específicos según sea necesario (ver también tabla 1). (1) la técnica de la población (SP) de lado originalmente se ha caracterizado en una población primitiva de las células madre hematopoyéticas, basado en la capacidad de emanación el tinte DNA Hoechst 3334226 de ATP-binding cassette (ABC) transportadores27. Células cardíacas de SP han sido aisladas por los distintos grupos y registrados para expresar una variedad de marcadores con algunas diferencias menores entre informes2,8,13,14. (2) células unidad formación de colonias de fibroblastos (CFU-Fs) originalmente se han definido en base a una células mesenquimales estromales (MSC)-como fenotipo. MSCs aislados se cultivan en los platos para inducir la formación de la Colonia. Formadoras de colonias MSC-como CFU-Fs puede ser aislado del corazón adulto y son capaces de diferenciarse en linajes cardíaca15. (3) Cardiosphere-las células derivadas de (enfermedades CDC) son las células derivadas de racimos de células de biopsias de tejido o explantes28,29,30,31. Recientemente fue demostrado que sobre todo la CD105+/CD90 /c-kit fracción de la célula exhibe cardiomiogenético y potencial regenerativo32.

Con SP-CPC aislado de ratones, presentamos un protocolo para la inducción eficiente de linaje endotelial basado en un estudio previo en el CPCs de rata y ratón CPCs SP33. El protocolo contiene adaptaciones específicas a la cultura y la técnica de expansión con respecto a la densidad celular, el contenido de suero del medio y el sustrato. Se puede aplicar no sólo a ratón SP-CPC pero distintos tipos de CPC para el propósito de inducir un cambio de destino de una amplificación a un CPC endoteliales comprometido, ya sea ante el trasplante de estas células o su uso para estudios mecanísticos en vitro .

Protocol

El uso de ratones para propósito de aislamiento celular estaba de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y con la ley de protección Animal Suiza y fue aprobado por las autoridades cantonales suizas. Nota: El aislamiento de Sca-1+/CD31– SP-CPC desde el corazón de ratón se hizo esencialmente descrita34 con algunas modificaciones. Para los materiales y reactivos utilizados, véase Tabla de materiales</stron…

Representative Results

Aislamiento de SP-CPC del ratón: En este estudio, utilizamos el CPC de ratón aislado según el fenotipo de SP, mientras que resultados de rata CPCs son modificados y añadidos de un anterior informe con permiso (figura 8)33. Proliferación celular en celulares alta y baja densidad y con concentraciones distintas de suer…

Discussion

Ventajas de este protocolo:

Este protocolo proporciona una técnica de diferenciación endotelial del CPCs. Hemos encontrado que una concentración baja del suero y densidad celular baja podrían mejorar la eficiencia de diferenciación endotelial, por el que LN demostró para ser un sustrato más adecuado que el FN en estas condiciones. Utilizamos dos tipos distintos de CPC: rata CPCs, que fueron utilizadas en una línea como forma de la célula y el ratón SP-CPC, que fueron aislados y ampliado…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Vera Lorenz por su apoyo a útil durante los experimentos y el personal de la instalación de citometría de flujo del Departamento de Biomedicina (DBM), Universidad y Universidad Hospital de Basilea. Este trabajo fue apoyado por el estancia en pista programa de la Universidad de Basilea (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster es apoyado por una beca de la Swiss National Science Foundation (grant número 310030_156953).

Materials

Culture medium
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071 3.5% (0.1% for lineage induction)
L-Glutamine  ThermoFisher #25030 Final concentration 2 mM
Glutathione Merck #G6013
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland #100-125
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #14170
0.05 % Trypsin-EDTA ThermoFisher #25300
T75 Flask Sarstedt #83.3911
Endothelial differentiation  
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Ham's F-12K (Kaighn's) Medium ThermoFisher #21127
Laminin  Merck #L2020
Fibronectin  Merck #F4759 Dilute in ddH2O
6 Well Plate Falcon #353046
Formaldehyde Solution Merck #F1635 Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration)
Triton X-100 Merck #93420 0.1% in ddH2O
Normal Goat Serum (10%) ThermoFisher #50062Z
Anti-von Willebrand Factor antibody Abcam #ab6994 1:100 in 10% goat serum
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher #A11010 1:500 in 10% goat serum
4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) ThermoFisher #62247 1:500 in ddH2O 
SlowFade Antifade Kit ThermoFisher #S2828
BX63 widefield microscope Olympus
Tube formation
96 Well Plate Falcon #353072
5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap Falcon #352235
Matrigel Growth Factor Reduced Corning #354230
IX50 widefield microscope Olympus
Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 
Reagents
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. in house hospital pharmacy #9077862 Working solution: 200 mg/kg
Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) ThermoFisher #20012
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) ThermoFisher #14175 Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS  for quenching Collagenase B activity 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate ThermoFisher #331885 Prepare DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
HEPES 1 M ThermoFisher #15630080 Final concentration 25 mM
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
RBC LysisBuffer (10X) BioLegend #420301/100mL Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter
Collagenase B Merck #11088807001 Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter
bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) Merck #B2261 Prepare 1 mg/mL in ddH2O
Verapamil-hydrochloride  Merck #V4629 Final concentration 83.3 µM 
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences #551262 0.25 µg/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) BD Biosciences #557405 0.6 µg/107cells
7-Aminoactinomycin D (7-ADD) ThermoFisher #A1310 0.15 µg/106cells
APC rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #553932 0.25 µg/107cells
FITC Rat IgG2a k Isotype Control BD Biosciences #554688 0.6 µg/107cells
Material
Needles 27G Terumo #NN-2719R
Needles 18G Terumo #NN-1838S
Single Use Syringes 1 mL sterile CODAN #62.1640
Transferpipette 3.5 mL Sarstedt #86.1171.001
Cell Strainer 40 µm blue BD Biosciences  #352340
Cell Strainer 100 µm yellow BD Biosciences #352360
Lumox Dish 50 Sarstedt #94.6077.305
Culture Dishes P100 Corning #353003
Culture Dishes P60 Corning #353004
Mouse
Line Age Breeding
C57BL/6NRj / male 12 weeks in house
Product Name Company Catalogue No.
Reagents
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) ThermoFisher #12440
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham Merck #D8437
Penicillin-Streptomycin  (P/S) ThermoFisher #15140122
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone #SH30071
L-Glutamine  ThermoFisher #25030
Glutathione Merck #G6013
B27 Supplement ThermoFisher #17504044
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech #AF-100-15
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) Peprotech #AF-100-18B
Cardiotrophin 1  Peprotech #250-25
Thrombin Diagontech AG, Switzerland  #100-125
Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit Lonza #CC-3162
Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. 
Product Name Medium 18 Medium 2 Medium 3
Reagents Culture Lineage induction Endothelial diff.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) 35% 35%
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham 65% 65%
Penicillin-Streptomycin  (P/S) 1% 1%
Fetal Bovine Serum (FBS) 3.5% ≤0.1%
L-Glutamine  2 mM 2 mM
Glutathione 0.2 nM 0.2 nM
B27 Supplement 1.3%
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) 6.5 ng/mL
Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) 13 ng/mL
Cardiotrophin 1  0.65 ng/mL

References

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Citer Cet Article
Mochizuki, M., Della Verde, G., Soliman, H., Pfister, O., Kuster, G. M. Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58370, doi:10.3791/58370 (2019).

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