低血清条件下で心臓前駆細胞の内皮への分化の誘導
Summary
このプロトコルでは、心臓前駆細胞の内皮への分化技術について説明します。特に、血清濃度と細胞播種密度が内皮細胞の分化に及ぼす影響について焦点を当てています。
Abstract
心臓前駆細胞 (CPCs) 外傷後心臓再生治療の可能性があります。大人の哺乳類の心臓で本質的な単価が極端に乏しいが拡張クリック単価は細胞治療の役に立つかもしれない。使用するための前提条件は、制御された方法で定義され、効率的なプロトコルを使用して様々 な心臓系統に分化する能力です。さらに、体外の拡大、患者から分離されたクリック単価または臨床病モデル疾患のメカニズムの調査のため有益な研究ツールを提供するかもしれない。
現在の研究では、クリック単価を識別するために異なるマーカーを使用します。しかし、それらのすべてはいくつかの臨床研究の橋渡しの影響を制限する人間で表現されます。標準化された拡張と細胞療法の目的のためのクリック単価のプライミングの分離技術とマーカーの発現に関係なく適用される微分のプロトコルになります。ここで述べる低ウシ胎児血清 (FBS) 濃度と低細胞密度条件下でクリック単価のプライミング マウスおよびラットのクリック単価の 2 つの異なる集団を使用してクリック単価の内皮への分化を促進、そのラミニンはよりことを示す次のプロトコルの下でこの目的のためフィブロネクチンより適当な基板: FBS、クリック単価をにおけるラミニンのシードの率を維持するサプリメントを含む培地で 2-3 日培養後と 3.5% < 60% 合流と培養政府短期証券 (0.1%) の内皮への分化培地で分化する前に 20-24 時間低濃度サプリメント自由な媒体。クリック単価は異種集団なので血清濃度とインキュベーション時間はそれぞれクリック単価個体の特性に応じて調整する必要があります。これを考慮し技術は同様にクリック単価の他のタイプに適用できる可能性とそれぞれ疾患モデルから分離されたクリック単価を使用する場合、どのようには病気によって影響と分化のメカニズムを検討する有用な方法を提供しています。
Introduction
最近の研究は大人の哺乳類心臓1,2,3居住者心臓前駆細胞 (クリック単価) の存在をサポートし、単価後心臓傷害4,細胞療法の有用な源になりうる5します。 さらに、拡張クリック単価が薬剤スクリーニングの有益なモデルを提供する、6、7モデルのまれな心筋症患者やそれぞれの病気から分離したときの疾病のメカニズムの調査研究。
成人の心臓から分離されたクリック単価が幹細胞/前駆細胞特性1,2,3,8を所有している彼らは、多能性、クローン、自己複製の能力を持っているとします。ただし、単価の異なる表面マーカー プロファイルを含む、たとえば、c キット、Sca 1、および他を展示または別の分離テクニック (表 1) によって取得の多くの異なる (サブ) 集団があります。いくつかの文化および分化のプロトコルが確立された1,2,8,9,10、11,12をされています。 13,14,15,16,17,18。これらのプロトコルは、主に対して、成長因子と血清量、培養の目的に応じて調整して、結果と分化効率を含む成果の違いにつながることができる変化します。
マーカーに基づく分離技術:
クリック単価は、特異的表面マーカー式1,2,8,9,10、11,12,13 に基づいて分離することができます。、14,15,16,17,18。以前の研究では、c キットと Sca 1 に常駐単価1,11,14,19,20を分離する最高のマーカーをかもしれないことを示唆しています。これらのマーカーのどれもが本当にクリック単価の特定、別のマーカーの組み合わせが通常適用されます。たとえば、クリック単価は、c キット21の低レベルを表現するのに対し c キットはまた22マスト細胞、血管内皮細胞23、および造血幹細胞/前駆細胞24を含む他の細胞型で表されます。その他の問題は、いないすべてのマーカーがすべての種の間で表されること事実です。これは、Sca 1、マウスではなく、人間25を表現するためのケースです。したがって、分離マーカーに依存しないプロトコルを使用した臨床試験やひと試料を用いた研究の観点から有利であるかもしれません。
マーカーに依存しない分離手法:
表面マーカー式の主に独立系であるが、これは、特定のマーカー陽性の亜分画の連続選択が (表 1を参照してください) を必要に応じてに洗練、CPC 分離のいくつかの主要な技法があります。(1) サイドの人口 (SP) 技術はもともと造血幹細胞による流出 DNA 色素ヘキスト 3334226機能 ATP 結合カセット (ABC) トランスポーター27の原始的な人口で特徴づけられています。心臓 SP 細胞は異なるグループによって分離されさまざまなレポート2,8,13,14のいくつかのマイナーな違いを使用してマーカーを表現する報告します。(2) コロニー形成線維芽細胞 (CFU Fs) もともと上で定義されたベース間葉系間質細胞 (MSC)-表現のような。コロニー形成を誘導するために料理に分離 MSCs を培養しています。このような MSC のような CFU Fs のコロニー形成は大人の心から分離できるので、心臓系統15に区別することができます。(組織生検から育つセルのクラスターから得られる単一のセルまたは28,29,30,31を外植体 3) 丹治派生セル (CDC)。主に CD105 最近示された+/CD90 cardiomyogenic と再生の潜在的な32–/c-kit–細胞画分を展示します。
ここで、マウスから隔離された SP クリック単価を使用して、クリック単価ラット、マウス SP 単価33の以前の研究に基づく内皮細胞系列の効率的な誘導プロトコルを提供します。プロトコルには、特定文化適応と拡張法細胞密度に対して、媒体、及び基板の血清量が含まれています。それはマウス SP 単価だけでなく、適用することができますが、内皮コミットのクリック単価を増幅するから運命のスイッチを誘発する目的のためのクリック単価の種類は、これらの細胞やその機構の in vitro研究用の移植の観点からします。
Protocol
細胞分離目的でマウスの使用スイスの動物保護法とケアと実験動物の使用のためのガイドに従ってされ、スイスのカントン当局によって承認されました。 注: Sca 1+/CD31 の分離-マウスの心臓から SP 単価本質的として行われていたいくつかの変更と前述の34 。材料および使用試薬、材料表を参照してください。すべての実験マ?…
Representative Results
マウスのクリック単価 SP 分離: 本研究ではラット単価から結果を変更およびアクセス許可 (図 8)33で以前のレポートから追加に対し SP 表現型によると分離されたマウスのクリック単価を使用しました。 細胞増殖の血清濃度と高、低細胞密度?…
Discussion
このプロトコルの利点:
このプロトコルは、クリック単価の内皮への分化技術を提供します。低血清濃度と細胞密度が低いが LN がこれらの条件の下で FN よりもより適切な基質をあることを証明という内皮への分化の効率を改善できるとわかった。クリック単価の 2 つのタイプを使いました: ラット分離され拡大した単価を細胞ラインのような方法とマウス SP クリック単価?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者実験と生物医学部 (DBM)、大学、バーゼル大学病院から流れ Cytometry 施設からスタッフの中には彼女の役に立つサポート ベラ ローレンツをありがちましょう。この作品は、滞在のトラック プログラム バーゼル大学から (享香望月) によって支えられました。ガブリエラ m. 型は、スイスの全米科学財団 (許可番号 310030_156953) からの助成金によってサポートされます。
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Biologie du développement. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks–an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
Citer Cet Article
Mochizuki, M., Della Verde, G., Soliman, H., Pfister, O., Kuster, G. M. Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58370, doi:10.3791/58370 (2019).