Visualisere Drosophila ben Motor Neuron Axons gennem voksen neglebånd
Summary
Her beskriver vi en protokol til at visualisere den cytoskeletale målretning med en fluorescerende proteiner i voksen ben af Drosophila fiksering, montering, imaging og efter imaging skridt.
Abstract
Størstedelen af arbejdet på specifikationen neuronal foretaget i genetisk og fysiologisk tractable modeller såsom C. elegans, Drosophila larver og fisk, som alle deltage i undulatory bevægelser (gerne kravle eller svømning) som deres primære tilstand af bevægelse. Dog en mere nuanceret forståelse af den enkelte motor neuron (MN) specifikation — i det mindste i form af informere sygdom behandlinger — kræver en lige så tractable system, der bedre modeller komplekse vedhæng-baserede locomotion ordninger af hvirveldyr. Drosophila voksen bevægeapparatet ansvaret for gåafstand opfylder alle disse kriterier med lethed, da i denne model er det muligt at studere specifikation af et lille antal let at skelne ben MNs (ca 50 MNs pr. ben) begge bruger en langt matrix af stærke værktøjer, genetiske og fysiologiske led i en ordning for vedhæng-baserede locomotion. Her beskriver vi en protokol for at visualisere ben muskler innervation i en voksen flue.
Introduction
Ligesom de hvirveldyr lemmer, er Drosophila voksen benet organiseret i segmenter. Hvert fly ben indeholder 14 muskler, som hver består af flere muskelfibre1,2. Voksen ben MNs celle organer er placeret i T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) og T3 (metathoracic) ganglier på hver side af den ventrale nerve ledningen (VNC), en strukturel analog med hvirveldyr rygmarven (figur 1). Der er ca 50 MNs i hver ganglier, hvor målet muskler i fire segmenter af ipsilaterale benet (coxa, trochanter, lårben og skinneben) (figur 1)3. Vigtigere, har hvert enkelte voksne ben MN en unik morfologiske identitet er meget stereotype mellem dyr3,4. Alle disse unikke MNs er afledt af 11 stamceller, kaldet neuroblasts (NBs) producerer ben MNs under larve faser3,4. I slutningen af de larve faser alle differentiere de umodne postmitotic MNs under metamorfose at erhverve deres specifikke dendritiske Dorne og cytoskeletale terminal mål, der definerer deres enestående morfologi3,4. Vi har tidligere testet den hypotese, at en kombinatorisk kode af transkriptionsfaktorer (TFs) angiver den entydige morfologi af hvert Drosophila voksen ben MN5. Som en model brugte vi lineage B, en af de 11 NB slægter, som producerer syv ud af MNs og påvist, at en kombinatorisk kode af TFs udtrykt i postmitotic voksen ben MNs dikterer deres individuelle morfologier. Af reprograming TF kode af MNs har vi kunnet skifte MN morfologier på en forudsigelig måde. Vi kalder disse TFs: MHF’er (morfologiske TFs)5.
En af de mest udfordrende dele af de morfologiske analyser af voksen MNs er at visualisere axoner via en tyk og auto-fluorescerende neglebånd med høj opløsning. Vi mærker normalt axoner med en membran-tagged NGL, der er udtrykt i MNs med et binært udtryk system, som DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP eller DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, hvor DVglut er en stærk drivkraft udtrykt i motoneurons6. Ved at kombinere disse værktøjer med andre klonede teknikker som mosaik analyse med en repressible markør (MARCM)7, cis-MARCM8eller MARCMbow5, kan vi begrænse normal god landbrugspraksis udtryk til delpopulationer af MNs gør de fænotypiske analyser af axoner lettere. Vi har genereret en protokol for at holde benet MN cytoskeletale morfologi intakt til billedbehandling og efterfølgende 3D rekonstruktion ved at løse specifikke problemer iboende til voksen Drosophila benet som (1) fiksering af de interne strukturer af voksen benet uden at det påvirker axon morfologi, endogene fluorescerende udtryk og ben muskulatur, (2) montering af ben for at bevare den overordnede struktur under en coverslip og i de relevante orientering til billedbehandling, og (3) billedbehandling for at få neglebånd baggrund samt cytoskeletale fluorescerende signal. Mens denne protokol har været detaljeret til påvisning af fluorescerende udtryk i MN axoner, kan det anvendes til at visualisere andre komponenter af ben neuromusculature i leddyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hårstrået voksen Drosophila og andre leddyr, der indeholder mange mørke pigmenter, er en væsentlig hindring for at se strukturer inde i deres krop. Det er derudover stærkt auto fluorescerende, som forværres af fiksering. Disse to funktioner er meget problematisk for observationer af fluorescerende farvestoffer eller molekyler inde i kroppen af dyr med en exoskeleton.
Den procedure, vi har beskrevet, og at vi rutinemæssigt bruger i laboratoriet udbytter ren og detaljerede billeder af axo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Robert Renard for at forberede flyve mad medium. Dette arbejde blev understøttet af en NIH grant NS070644 til R.S.M. og finansiering fra ALS Association (#256), FRM (#AJE20170537445) og ATIP-Avenir Program til J.E.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
