Un approccio di mutagenesi romanzo saturazione: Unico passaggio caratterizzazione della proteina regolatrice siti in RNA usando fosforotioati di legame
Summary
Proteine che legano specifiche sequenze di RNA giocano un ruolo critico nell’espressione genica. Caratterizzazione dettagliata di questi siti di legame è cruciale per la nostra comprensione della regolazione genica. Qui, è descritto un approccio passo-passo per mutagenesi di saturazione dei siti di legame delle proteine nel RNA. Questo approccio è rilevante per tutti i siti di legame delle proteine nel RNA.
Abstract
Regolazione genica svolge un ruolo importante nello sviluppo. Numerose proteine DNA e RNA-associazione legano loro sequenze bersaglio con elevata specificità per controllare l’espressione genica. Queste proteine regolatrici controllano l’espressione genica a livello del DNA (trascrizione) o a livello di RNA (pre-mRNA che impiomba, poliadenilazione, trasporto del mRNA, decadimento e traduzione). Identificazione di sequenze regolatrici aiuta a capire non solo come un gene è acceso o spento, ma anche quali geni a valle sono regolati da una particolare proteina regolatrice. Qui, descriviamo un approccio one-step che consente la mutagenesi di saturazione di un sito di legame della proteina nel RNA. Si tratta di doping mascherina del DNA con non-selvaggio-tipo nucleotidi all’interno del sito di legame, sintesi di RNA separata con ogni nucleotide fosforotioato e l’isolamento della frazione legata dopo incubazione con proteine. Interferenze da parte di non-selvaggio-tipo nucleotidi provoca loro esclusione preferenziale dalla frazione legata alle proteine. Questo è monitorato mediante elettroforesi in gel dopo fenditura chimica selettiva con iodio di legami fosfodiesterei contenente fosforotioati (mutagenesi fosforotioato o PTM). Questo approccio di mutagenesi passo singolo saturazione è applicabile per la caratterizzazione di qualsiasi sito di legame della proteina nel RNA.
Introduction
Regolazione genica svolge un ruolo importante nella biologia. Geni possono essere regolati a livello di trascrizione, impionbatura pre-mRNA, 3′ fine formazione, esportazione di RNA, traduzione, localizzazione di mRNA, decadimento, modificazione post-traduzionale/stabilità, ecc che entrambe le proteine DNA e RNA-associazione giocano un ruolo chiave nel gene regolamento. Mentre le analisi genetiche molecolari hanno identificato numerose proteine regolatorie, solo un piccolo sottoinsieme di esse sono state caratterizzate completamente per loro funzioni cellulari o associazione siti in vivo. Mutagenesi e l’analisi di sequenza filogenetica offrire approcci complementari per caratterizzare le interazioni DNA o RNA-proteina.
Le proteine RNA-leganti sono importanti nei processi di sviluppo, tra cui la differenziazione sessuale. La proteina di Drosophila Sex-lethal (SXL) o la proteina di sesso-interruttore generale è assente nei maschi, ma presente nelle femmine. Essa riconosce sequenze ricche uridina o pirimidina-tratti adiacenti ai luoghi specifici della giuntura in a valle pre-mRNA bersaglio (trasformatore, sesso-letalee maschio-specific lethal2) in cellule somatiche1,2 ,3,4. Inoltre, esso regola sito di poliadenilazione commutazione legandosi alle sequenze di enhancer poliadenilazione uridina-ricco in trascrizione rinforzatore di rudimentali (e(r))5,6. SXL probabile regola obiettivi supplementari sulla linea germinale femminile che devono ancora per essere identificati1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Caratterizzazione di un sito di legame coinvolge tipicamente, mutagenesi, ad esempio, per l’eliminazione o sostituzione di uno o più nucleotidi. Ogni sito di legame mutante, riguardante la sequenza di RNA wild-type, viene poi analizzata utilizzando una serie di concentrazioni di proteina per determinare la sua affinità di legame (dissociazioneKd o equilibrio costante) per la proteina di interesse; Kd è la concentrazione di proteine necessaria per ottenere 50% legame al RNA. Questo processo laborioso di mutagenesi dettagliata comporta generazione e analisi di numerosi mutanti — tre nucleotidi non-wild type per ogni posizione nel sito di legame. Così, c’è la necessità di un approccio alternativo per mutagenesi di saturazione più veloce, più semplice ed economica di siti di legame della proteina nel RNA.
Qui, descriviamo un approccio one-step che consente la mutagenesi di saturazione di un sito di legame della proteina nel RNA. Si tratta di doping mascherina del DNA con non-selvaggio-tipo nucleotidi all’interno del sito di legame, sintesi di RNA separata con ogni nucleotide fosforotioato e l’isolamento della frazione legata dopo incubazione con proteine. Interferenze da parte di non-selvaggio-tipo nucleotidi provoca loro esclusione preferenziale dalla frazione legata alle proteine. Questo è monitorato mediante elettroforesi in gel dopo fenditura chimica selettiva con iodio di legami fosfodiesterei contenente fosforotioati (mutagenesi fosforotioato o PTM). Questo approccio di mutagenesi passo singolo saturazione è applicabile per la caratterizzazione di qualsiasi sito di legame della proteina nel RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenesi lungo è stata utilizzata per caratterizzare i siti di legame proteico. In primo luogo, una serie di mutanti può essere costruita e testata singolarmente nelle analisi per analizzare i loro effetti sull’affinità di legame di associazione. Mentre un approccio di mutagenesi standard offre un modo per analizzare diverse sequenze, più passaggi coinvolti nell’approccio standard, quali costruzione di mutanti e l’esecuzione di una serie di reazioni per ogni mutante di associazione, è laboriosa e richiede tempo e …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’autore ringrazia il National Institutes of Health per il finanziamento di passato e grazie Michael R. Green per la sintesi di oligonucleotidi.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Génétique. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
