一种新的饱和诱变方法: 利用 Phosphorothioates 对 RNA 调控蛋白结合位点的单步表征
Summary
结合特定 RNA 序列的蛋白质在基因表达中扮演重要角色。对这些结合部位的详细描述对于我们理解基因调控至关重要。本文介绍了 RNA 蛋白质结合部位饱和诱变的单步法方法。这种方法与 RNA 中的所有蛋白结合部位有关。
Abstract
基因调控在发展中起着重要的作用。大量的 DNA 和 RNA 结合蛋白结合其靶序列的高特异性来控制基因表达。这些调控蛋白控制基因表达无论是在 DNA 水平 (转录) 或在 RNA 水平 (前 mRNA 剪接, polyadenylation, mrna 传输, 衰变和翻译)。规范序列的识别不仅有助于了解基因是如何开启或关闭的, 而且还能理解哪些下游基因是由特定的调控蛋白调控的。在这里, 我们描述了一步方法, 允许在 RNA 的蛋白质结合点的饱和诱变。它涉及掺杂 DNA 模板与非野生型核苷酸在结合部位, 合成单独 rna 与每个硫代核苷酸核苷酸, 并分离的束缚分数后孵化与蛋白质。非野生型核苷酸的干扰会导致它们在蛋白质束缚分数上的优先排斥。这是由凝胶电泳监测后, 选择性化学分裂与碘磷酸二酯债券含有 phosphorothioates (硫代核苷酸诱变或 PTM)。这种单步饱和诱变方法适用于 RNA 中任何蛋白质结合部位的表征。
Introduction
基因调控在生物学中起着重要的作用。基因可以调节在转录水平, 前 mRNA 剪接, 3 ‘ 末端形成, RNA 出口, 翻译, mRNA 定位, 衰变, 后转化/稳定性等. DNA 和 RNA 结合蛋白在基因中起关键作用调节。虽然分子遗传学分析已经确定了许多调控蛋白, 但它们中只有一小部分被完全用于细胞功能或体内的结合部位。系统进化序列分析和突变提供了互补的方法来表征 DNA 或 RNA-蛋白质相互作用。
RNA 结合蛋白在发育过程中很重要, 包括性分化。果蝇蛋白性致死 (SXL) 或主性开关蛋白不在男性, 但存在于女性。它能识别在体细胞1,2 中, 苷的序列或嘧啶-在下游前 mRNA 目标 (变压器,性致死和男性特定的 lethal2) 附近的特定剪接点. ,3,4。此外, 它通过结合苷丰富的 polyadenylation 增强器序列在基本(e (r)) 成绩单5,6中约束 polyadenylation 站点切换。SXL 可能对仍有待确定的女性生殖中的其他目标进行调节, 1、7、8、9、10、11、12,13。
通常, 绑定站点的特征包括突变, 例如, 通过删除或替代单个或多个核苷酸。每个突变结合点, 相对于野生类型的 RNA 序列, 然后分析使用一系列的蛋白质浓度, 以确定其结合亲和性 (Kd 或平衡离解常数) 的蛋白质的利益;Kd 是获得 50% RNA 结合所需的蛋白质浓度。这一劳动密集型的详细诱变过程涉及对众多突变体的产生和分析, 即三种非野生型核苷酸用于结合部位的每个位置。因此, 需要一种替代的方法, 以更快, 更简单, 廉价的饱和突变的蛋白质结合点在 RNA。
在这里, 我们描述了一步方法, 允许在 RNA 的蛋白质结合点的饱和诱变。它涉及掺杂 DNA 模板与非野生型核苷酸在结合部位, 合成单独 rna 与每个硫代核苷酸核苷酸, 并分离的束缚分数后孵化与蛋白质。非野生型核苷酸的干扰会导致它们在蛋白质束缚分数上的优先排斥。这是由凝胶电泳监测后, 选择性化学分裂与碘磷酸二酯债券含有 phosphorothioates (硫代核苷酸诱变或 PTM)。这种单步饱和诱变方法适用于 RNA 中任何蛋白质结合部位的表征。
Protocol
Representative Results
Discussion
突变一直被用来表征蛋白质结合部位。首先, 一系列突变体可以构造和单独测试的结合检测, 以分析其对结合亲和性的影响。虽然标准突变方法提供了一种分析多个序列的方法, 但标准方法中涉及的多个步骤, 如构造突变体和对每个变种人执行一系列绑定反应, 都是费力和耗时的, 可能不会允许饱和诱变, 特别是对较长的序列。第二, 序列可以是随机的和池用于多周期的结合和聚合酶链反应 (PCR) 放大?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢国立卫生研究院过去的资助和感谢迈克尔 r. 格林合成寡核苷酸。
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
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