Summary

Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikel von Erwachsenen Schistosoma japonicum

Published: May 22, 2018
doi:

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur extrazellulären Vesikel (EVs) Isolierung in in Vitro kultivierten Medium von Erwachsenen Schistosoma Japonicumbeschreiben.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind häutig Vesikel, die von einer Vielzahl von Zellen in der extrazellulären Mikroumgebung veröffentlicht. EFD repräsentieren eine Bevölkerung von heterogenen Vesikel, deren Größe zwischen 40 und 1.000 nm. Gesammelte Beweise gezeigt, dass EVs in Erreger-Wirt Interaktionen eine wichtige regulatorische Rolle spielen. Ein tiefes Verständnis der schistosome-EVs soll Einblicke in die Mechanismen schistosome–Wirt Interaktionen, ermöglicht die Entwicklung neuer Strategien gegen Bilharziose. Hier wollen wir weiter studieren EVs Funktionen in Schistosomen durch Vorlage eines Protokolls für die Isolierung und Charakterisierung des EFD vom Erwachsenen Schistosoma Japonicum (S. Japonicum). EVs wurden von in-vitro- Kulturmedium mit Zentrifugation kombiniert mit einem kommerziellen exosom isolierungskit isoliert. Die isolierten S. Japonicum EVs (SjEVs) in der Regel besitzen einen Durchmesser von 100-400 nm, und zeichnen sich durch Übertragung elektronischer Mikroskopie und westliche Beflecken. Die Verwendung von PKH67 Farbstoff-markierten SjEVs hat gezeigt, dass SjEVs durch den empfängerzellen internalisiert werden. Insgesamt bietet unser Protokoll eine alternative Methode zur Isolierung von EVs von Erwachsenen Schistosomen; die isolierten SjEVs möglicherweise für Funktionsanalyse geeignet.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind eine Bevölkerung von kleinen Membrane-springen Vesikel mit verschiedenen Proteine, Lipide und Nukleinsäuren gekapselt. Jüngste Studien gezeigt, dass EVs eine entscheidende Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation spielen und sind beteiligt an der Regulation des zahlreiche physiologische Prozesse, einschließlich der Zellentwicklung, Immunregulation, Angiogenese und Zelle Migration2, 3,4,5. Sammeln Beweise gibt, dass EVs, zirkulierenden exosomen und ihre Fracht MiRNA potenzielle Biomarker für bestimmte Krankheiten6darstellt.

Einige Protozoen wie Trichomonas Vaginalis, Trypanosomen Trypanosomaund Leishmania Spp., haben gezeigt, dass EVs; absondern zu können Helminthen zusätzlich gefunden wurden, EVs in lebenden absondern beherbergt7. Parasitäre EVs wurden gezeigt, bei der Aufrechterhaltung der Infektion, Pathogenität8und Immunregulation9einbezogen werden. Aktuelle Studien in Schistosomen beide Schistosoma Mansoni (S. Mansoni) 10,11 und S. Japonicum12 haben gezeigt, dass Erwachsene Schistosomen exosom erinnernden Bläschen absondern, die möglicherweise die funktionale Vorschriften bestimmte biologische Prozesse beteiligt.

Bisher wurden verschiedene Methoden zur extrazellulären Vesikel, wie Ultrazentrifugation, Ultrafiltration13, die Verwendung von Polymer-basierten Reagenzien, Größe-Ausschluss-Chromatographie und immunoaffinitäts Isolation isolieren. Diese verschiedenen Methoden besitzen ihre eigenen Vorzüge und Grenzen14. Im Allgemeinen gilt Ultrazentrifugation die Goldstandard-Methode für die Vesikel Isolierung. Allerdings leidet diese Methode aus der Beschränkung des potenziellen EV Aggregation14.

In Schistosomen, eine Reihe von Methoden zur Isolierung der EV gemeldet wurden: dazu gehören Ultrazentrifugation11,12,10 und die Verwendung von kommerziellen EV Isolation Kit16 für mehrere Stufen (Eiern16, Schistosomula11, Erwachsene Schistosomen10,12,17). Da die Microvesicles einer breiten Palette von mehreren hundert Nanometer bis tausend Nanometer groß sind, entwickelten wir einer alternativen Methode, die kombiniert mit dem Einsatz von Bank-Zentrifuge, Ultrafiltration und eine kommerzielle EV isolierungskit der EVs von isolieren Erwachsenen Schistosoma Japonicum. Die isolierten EVs in der Regel besaß einen Durchmesser von 100-400 nm und wurden erfolgreich durch den empfängerzellen verinnerlicht.

Protocol

Alle Tierversuche wurden genehmigt durch die lokale Ethikkommission des Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences (erlauben Nummer: SHVRIAU-14-0101). 1. in-vitro- Kultur von Schistosomen Hinweis: Schistosomen repräsentieren ein Biohazard. Arbeiter tragen Latex Handschuhe überhaupt mal beim Umgang mit Würmern, schistosomal Suspensionen oder anderen biologische Materialien im Zusammenh…

Representative Results

Um die Ausbeute an isolierten SjEVs mit Hilfe der beschriebenen Protokoll zu quantifizieren, haben wir die Konzentration des Proteins von der isolierten SjEVs von 28 Tagen Erwachsene Schistosomen Zugriff auf BCA Protein Assay verwendet. Wie aus Tabelle 1hervorgeht, reichte die SjEV Proteinkonzentration von 208 µg bis 250 µg pro 100 mL Medium (Tabelle 1). Die Partikelgröße Malvern Nanopartikel Analyse bestimmt darauf hingewiesen, dass die isolierte SjE…

Discussion

Neuere Studien über EFD nachgewiesen, dass Schistosome EVs spielen eine wichtige Rolle in Wirt-Pathogen Interaktionen3,9,12,16. Weitere Adresse unbedingt ihre Regulierungsaufgaben EVs von Schistosomen zu isolieren. Hier beschreiben wir eine alternative Methode zur SjEV Isolierung. Diese Methode führt zu eine breiten Palette Größe von SjEVs, von 100 nm bis 400 nm, bei Erwachsenen S. Japo…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie war, im Teil oder im ganzen, unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (31472187 und 31672550) und The Agricultural Science and Technology Innovation Program von der chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften.

Materials

Material
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) ThermoFisher SCIENTIFIC 4478359 For isolating S. japonicum extracellular vesicles
PKH67 Sigma-aldrich MINI67 For labeling Evs
RPMI 1640 Medium ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119 For parasite culture
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122
0.22μm syringe filter Merck SLGP033RB
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo SCIENTIFIC 68035
PEG8000 Sangon Biotech A100159 
RIPA Beyotime P0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Fisher scientific WBKLS0100 
DAPI Cell Signaling Technology 4083
BCA kit Beyotime P0010
CD63 antibodies Sangon Biotech D160973-0025
PVDF Bio-Rad 1704273
Formvar/Carbon 400 mesh Ted Pella 01754-F
Phosphotungstic Acid Ted Pella 19402
anti-mouse IgG-HRP CWBIO CW0102
NCTC clone 1469 cells ATCC ATCC® CCL-9.1™
FBS HyClone SV30087.02
Equipments
GE chemoluminescance imaging system GE ImageQuant LAS4000mini
Transmission electron microscopy Hitachi H-7600
Milli-Q water Milli-Q Milli-Q Elix
Eppendor Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5804R
Zetasizer Nano Malvern Zetasizer Nano ZS 
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Ultracentrifuge
Incubator ESCO CCL-107B
Microscope Zeiss Zeiss Axin Observer Z1

References

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Citer Cet Article
Liu, J., Zhu, L., Wang, L., Chen, Y., Giri, B. R., Li, J., Cheng, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum. J. Vis. Exp. (135), e57514, doi:10.3791/57514 (2018).

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