Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber
Summary
Wir haben eine neuartige chirurgische Protokoll für die zwei-Photonen-Bildgebung live Mäuse Leber mit minimaler Invasion. Mit dieser Technik haben wir die detaillierte Struktur der Leber während Lipopolysaccharid-induzierte Endotoxämie identifiziert. Wir erwarten, dass diese Methode verwendet werden, kann um die Wirksamkeit der verschiedenen Reagenzien Behandlung zur hepatischen Leukozyte Migration zu bestimmen.
Abstract
Sepsis ist eine schwere Infektion, die Organversagen und Gewebe verursachen kann Schaden. Obwohl die Mortalität und Morbidität Preise im Zusammenhang mit Sepsis sind extrem hoch, keine direkte Behandlung oder im Zusammenhang mit der Orgel Mechanismus wurde ausführlich in Echtzeit geprüft. Die Leber ist das zentrale Organ, das Gifte und Infektionen im menschlichen Körper steuert. Hier wollten wir intravitalen Bildgebung der Maus Leber nach Induktion der Endotoxämie durchführen, um die Beweglichkeit der Immunzellen, wie Neutrophilen und Leber Kapsel Makrophagen (LCMs) verfolgen. Dementsprechend haben wir eine neuartige Operationsmethode für die Exposition der Leber mit minimal-invasiven Chirurgie entwickelt. Mäuse wurden mit Lipopolysaccharid (LPS), eine gemeinsame Endotoxin intraperitoneal injiziert. Mit unserer neuen chirurgischen Ansatz für Belichtung und intravitalen Bildgebung der Leber, wir fanden, dass die Neutrophilen Maus Rekrutierung in LPS behandelten LysM-grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde Maus Leber erhöht im Vergleich mit dem in Phosphat-gepuffert Leber mit Kochsalzlösung behandelt. Nach LPS-Behandlung stieg die Zahl der Neutrophilen deutlich mit der Zeit. Darüber hinaus visualisiert mit Hilfe von CX3Cr1-GFP-Mäusen, wir erfolgreich Leber residente Makrophagen genannt LCMs. Daher kann um die Wirksamkeit der neuen Reagenzien zur Steuerung immun Mobilität in Vivozu untersuchen, Bestimmung der Motilität und Morphologie der Neutrophilen und LCMs in der Leber wir therapeutische Wirkung im Organ Versagen und Gewebe Schäden durch identifizieren können Leukozyten-Aktivierung bei Sepsis.
Introduction
Die Leber ist der großen Stoffwechselorgan bei Säugetieren; Es fungiert als ein Kontrollturm für Energie, Hormone und Entgiftung1. Aufgrund seiner Bedeutung haben Forscher um die Veränderungen in der Leber während einer Entzündung zu erhellen viele in Vitro und in Vivo Experimente durchgeführt. Intravitalen Mikroskopie wurde verwendet, um live-Bilder aus der Leber2 zu erfassen. In der Tat führte verschiedene Leber bildgebende Verfahren wurden2,3,4,5,6. Jedoch um einen vereinfachten chirurgischen Ansatz entwickeln und Stabilisierung der das Zielorgan und die Immunzellen, gestalteten wir ein einfaches Protokoll, das Forscher um minimieren Sie ihren Aufwand für die intravitalen Bildgebung führen können.
In dieser Studie führten wir eine stabile und neuartige bildgebende Kammer und chirurgische Technik, die verwendet werden könnte, um Blutungen und mögliche Infektionen zu minimieren. Wir bestätigen, dass die Leber für mehr als 2 h intakt geblieben. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Morphologien LCMs7 und Neutrophilen unter septischen Zustand identifiziert. Da diese Methode physikalische und biologische Störfaktoren wie Zittern und unerwartete Entzündung während chirurgischen Eingriffs minimiert wird, erwarten wir, dass diese Methode verwendet werden könnte, um akute Reaktionen der immunen Zellen in der Leber als Reaktion auf zu beobachten Reagenzien wie LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Leber wurde aktiv von vielen Gruppen3,10, aufgrund der Bedeutung ihrer Funktion untersucht. Zum Beispiel schlug Heymann Et Al. eine empfindliche Methode mit Agarose. Obwohl diese Methode erwies sich hochpräzise, dauert die Agarose-Einstellung. Jedoch konnte alle Verfahren mit unserer Methodik innerhalb von 30 min, andere Störfaktoren zu minimieren durchgeführt. Zweitens ist die Stabilisierung der Leberzellkrebs äußerst wichtig, weil der Herzschlag der Vi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch die Regierung von Korea (MSIP, Grant Nr. 2016R1A2B4008199 Y-m. (H.), Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (gewähren Nummer: HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
