脂多糖治疗小鼠肝脏免疫应答中白细胞的双光子活体成像
Summary
我们建立了一种新的小鼠肝脏双光子成像的手术方案。利用这一技术, 我们确定了肝内毒素诱导中的内毒素血症的详细结构。我们预期这种方法可以用来确定各种试剂治疗肝白细胞迁移的有效性。
Abstract
脓毒症是一种严重的感染, 可能导致器官衰竭和组织损伤。虽然与脓毒症有关的死亡率和发病率极高, 但没有对直接治疗或与器官有关的机制进行详细的实时检查。肝脏是管理人体内毒素和感染的关键器官。本文旨在对内毒素血症诱导后的小鼠肝脏进行活体成像, 以跟踪免疫细胞的运动, 如中性粒细胞和肝囊巨噬细胞 (LCMs)。因此, 我们设计了一种新的手术方法, 以接触肝脏微创手术。小鼠腹腔注射脂多糖 (LPS), 一种常见的内毒素。利用我们的新的手术方法, 接触和活体成像的小鼠肝脏, 我们发现, 中性粒细胞招募在 LPS 治疗 LysM 绿色荧光蛋白 (GFP) 小鼠肝脏增加与磷酸盐缓冲生理盐水治疗的肝脏。LPS 治疗后, 中性粒细胞数量随着时间的推移显著增加。此外, 使用 CX3Cr1-GFP 小鼠, 我们成功地可视化肝居民巨噬细胞称为 LCMs。因此, 为了研究新的试剂对控制免疫移动性的有效性在体内, 确定中性粒细胞和 LCMs 在肝脏中的运动和形态学, 可以让我们发现在器官衰竭和组织损伤中所造成的治疗作用白细胞在脓毒症中活化。
Introduction
肝脏是哺乳动物的主要代谢器官;它充当能量、荷尔蒙和解毒的控制塔1。由于其重要性, 研究人员已经进行了许多体外和体内实验来阐明炎症过程中肝脏的变化。活体显微镜已被用来捕捉活体图像从肝脏2 。的确, 各种肝脏成像方法已经被引入2,3,4,5,6。然而, 为了发展一个更简化的手术方法, 并实现目标器官和免疫细胞的稳定, 我们设计了一个简单的协议, 可以指导研究人员减少他们的活体成像的努力。
在本研究中, 我们介绍了一个稳定和新的成像室和外科技术, 可用于减少出血和可能感染。我们证实肝脏保持完好超过2小时。利用这种方法, 我们成功地确定了 LCMs7的形态和脓毒性条件下的中性粒细胞。由于这种方法最大限度地减少物理和生物混杂因素, 如颤抖和意外炎症在外科手术过程中, 我们预计, 这种方法可以用来观察急性反应的免疫细胞在肝脏响应像 LPS 的试剂
Protocol
Representative Results
Discussion
由于其功能的重要性, 许多组3,10都积极研究了肝脏。例如, Heymann et al. 提出了一种微妙的方法使用琼脂糖。虽然这种方法被认为是高度精确的, 琼脂糖设置需要时间。然而, 用我们的方法, 所有的程序可以在30分钟内进行, 尽量减少其他混杂因素。第二, 稳定肝脏是非常重要的, 因为心跳会扰乱视频。为了消除这种现象, 我们将小鼠重新定位到合适的卧位位?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了韩国政府资助的韩国国家研究基金会 (NRF) 的一笔赠款 (MSIP; 对 Y-m 的赠款2016R1A2B4008199H.) 和大韩民国卫生 & 福利部 (赠款号: HI14C1324)。
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
