Summary

Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

Published: February 06, 2018
doi:

Summary

Estabelecemos um protocolo cirúrgico romance para a imagem latente de dois fotões de fígado de ratos ao vivo com invasão mínima. Com esta técnica, identificamos a estrutura detalhada do fígado durante endotoxemia induzidas pelo lipopolissacarídeo. Nós antecipamos que este método pode ser utilizado para determinar a eficácia de vários tratamentos de reagentes para migração de leucócitos hepática.

Abstract

Sepse é um tipo de infecção grave que pode causar a falha de órgãos e tecidos danos. Embora as taxas de mortalidade e morbidade associada com sepse são extremamente elevado, não direto tratamento ou órgãos relacionados com o mecanismo foi examinado em detalhes em tempo real. O fígado é o órgão chave que gerencia as toxinas e infecções no corpo humano. Neste documento, tivemos como objetivo realizar intravital imagem latente do fígado de rato após indução de endotoxemia para acompanhar a motilidade das células do sistema imunológico, tais como neutrófilos e macrófagos capsulares hepáticas (LCMs). Nesse sentido, nós projetamos um novo método cirúrgico para exposição do fígado com cirurgia minimamente invasiva. Os ratos foram injetados intraperitonealmente com lipopolissacarídeo (LPS), um endotoxina comum. Usando nossa nova abordagem cirúrgica para exposição e intravital imagem do recrutamento rato fígado, que encontramos o neutrófilo em proteína de LPS-tratados LysM-verde fluorescente (GFP) fígado de rato foi aumentado em comparação com isso em tampão fosfato fígado de tratados com solução salina. Após o tratamento de LPS, o número de neutrófilos aumentou significativamente com o tempo. Além disso, estamos com êxito usando ratos CX3Cr1-GFP, visualizado fígados macrófagos residentes chamados LCMs. Portanto, para investigar a eficácia de novos reagentes para controlar a mobilidade imune na vivo, determinando a motilidade e morfologia dos neutrófilos e LCMs no fígado pode permitem identificar efeito terapêutico no órgão falha e tecido danos causados por ativação de leucócitos na sepse.

Introduction

O fígado é o órgão metabólico importante nos mamíferos; Ele atua como uma torre de controle para desintoxicação, hormônios e energia1. Devido à sua importância, os pesquisadores realizaram muitos experimentos in vitro e in vivo para elucidar as alterações no fígado durante a inflamação. A microscopia intravital tem sido usada para capturar imagens ao vivo do fígado2 . Com efeito, fígado de vários métodos de imagem têm sido introduzidos2,3,4,5,6. No entanto, a fim de desenvolver uma abordagem cirúrgica mais simplificada e estabilização do órgão-alvo e as células do sistema imunológico, nós projetamos um protocolo simples que pode orientar pesquisadores para minimizar o seu esforço para a imagem latente intravital.

Neste estudo, introduzimos uma câmara de imagem estável e romance e uma técnica cirúrgica que pode ser usada para minimizar o sangramento e possível infecções. Confirmamos que o fígado permaneceu intacto por mais de 2 h. Com este método, identificamos com êxito morfologias de LCMs7 e neutrófilos sob condição séptica. Desde que esse método minimiza fatores confundimento, físicos e biológicos, tais como inflamação trêmula e inesperada durante o procedimento cirúrgico, prevemos que este método pode ser usado para observar reações agudas de células imunes no fígado em resposta a reagentes como LPS.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê de uso de Yonsei Universidade faculdade de medicina, Coreia e institucional Cuidado Animal. Proteína de LysM-verde fluorescente (GFP; gfp / +) ratos8 e CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 ratos em 8-12 semanas de idade foram utilizados para a imagem latente intravital. Todos os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados e desinfetados com álcool a 70%. 1. personalizados rat…

Representative Results

Foi criada uma câmara de imagens simples e muito estável. Parte inferior da câmara estava coberta com silicone, que impediu a escorregar do rato corpo e órgãos. Além disso, porque o silício tem a quantidade adequada de elasticidade, poderia impedir esperado danos induzidos pela pressão do slide tampa (figura 1A, C). Segunda, tecido-cofre cola (sulfite de Vet) foi aplicada a fim reparar o fígado extraído na cama do silicone em forma …

Discussion

O fígado tem sido ativamente estudado por muitos grupos3,10, devido à importância da sua função. Por exemplo, Heymann et al sugeriram um método delicado usando agarose. Embora esse método foi encontrado para ser altamente precisos, a configuração de agarose leva tempo. Todavia, com nossa metodologia, todos os procedimentos podem ser efectuados dentro de 30 min, minimizando outros fatores de confundimento. Em segundo lugar, estabilizar o fígado é extrem…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi suportado por um fundo de nacional pesquisa Fundação de Coreia (NRF) financiado pelo governo da Coreia (MSIP; concessão n. º 2016R1A2B4008199, Y-m. H.) e o Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI14C1324).

Materials

Custom designed chamber Live Cell Instruments Custom-designed size
Metal cover slide Live Cell Instruments Custom-designed size
Cover glass Electron Microscopy Sciences #72204-03
Sylgard 184 Silicone elastomer kit Dow Corning
Erlenmeyer flask DURAN 21 216 36
Cell culture plate (Flat type) HYUNDAI Micro Co. H31006
Desiccator ADARSH 55204
High Q BOND SE 5 mL BJM LAB To make semi-permanent dam
Flexible Silicone Rubber Heaters Omega SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800
DC power supply Toyotech DP30-03A
Phosphate-buffered saline Home-made
Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis Sigma-Aldrich L6011
Texas Red Dextran Thermo Fisher Scientific D1830
15 mL High-clarity polypropylene
conical tube
FALCON 14-959-49B
0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) Sartorius 16555k
1.5ml Micro Tube, Amber Axygen MCT-150-X For light-blocking
1 mL syringe Korea Vaccine KV-S01
3 mL syringe Korea Vaccine KV-S03
10 mL syringe Korea Vaccine KV-S10
0.3 mL insulin syringe Becton Dickinson 324900
Hair removal cream 100 mL Body natur
Cotton swab ABDI
Zoletil 50 5 mL Virbac
Rompun 10 mL Bayer
Heating plate Live Cell Instruments PH-S-10 Custom-designed size
DC controller Live Cell Instruments CU-301
Microdessection Scissors Harvard Apparatus 72-5418
Scissors Roboz RS-5882
Forceps Roboz RS-5137
Vet bond 3M 1469SB
ZEN software (Black Edition) Carl Zeiss Program for LSM 7 MP
LSM 7 MP Carl Zeiss
Volocity PerkinElmer Analysis program

References

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Citer Cet Article
Park, S. A., Choe, Y. H., Lee, S. H., Hyun, Y. Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver. J. Vis. Exp. (132), e57191, doi:10.3791/57191 (2018).

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