Summary

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

Published: May 08, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים שתי מתודולוגיות הרומן, psPACT, mPACT, להשגת שקיפות אופטית מקסימלי וניתוח מיקרוסקופיים עוקבות של רקמות להערכת למכרסמים שלם כל מערכת העצבים המרכזית.

Abstract

מאז הפיתוח של בהירות, bioelectrochemical פינוי טכניקה המאפשרת למיפוי פנוטיפ תלת מימדי בתוך רקמות שקוף, שפע של מתודולוגיות סליקה הרומן כולל מעוקב (הדמיה מוחית ברור, בלא הפרעה קוקטיילים וניתוח חישובית), מתג (פקד-מערכתיות של אינטראקציה עם הזמן) וקינטיקה של כימיקלים, מפה (מוגדל ניתוח של פרוטאום) ו ברית (טכניקה בהירות פסיבי), הוקמו להרחיב את ערכת הכלים הקיימים עבור ניתוח מיקרוסקופי של רקמות ביולוגיות. מטרות המחקר הנוכחי כדי לשפר ולמטב את הנוהל ההסכם המקורי עבור מערך של רקמות מכרסמים שלם, כולל את כל מערכת העצבים המרכזית (CNS), הכליות, הטחול העכבר כל העוברים. כינה psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), טכניקות הרומן אלה מספקים אמצעי מניעה תכופה מיפוי תא המעגלים והצגה של מבנים subcellular ברקמות נורמליים ופתולוגיים ללא פגע. בפרוטוקול הבא, אנו מספקים מתווה מפורט, צעד אחר צעד כיצד להשיג סיווג רקמות מקסימלי עם הפלישה מינימלי של המבנית שלהם דרך psPACT ו- mPACT.

Introduction

המטרה הבסיסית חקירה מדעית וקלינית כרוכה השגת הבנה מלאה של איבר מבנה ותפקוד; עם זאת, האופי המורכב ביותר של איברים יונקים לעתים קרובות מגישה כמחסום להשגת המטרה הזו1באופן מלא. בהירות (החלפת השומנים ברור hybridized אקרילאמיד נוקשה הדמיה תואמי Tisssue-הידרוג)2,3,4, הכוללת בנייה של היברידית הידרוג מבוססי אקרילאמיד רקמות ללא פגע, משיגה סיווג אופטי מגוון רחב של איברים, כולל את המוח, הכבד, הטחול, תוך שמירה על שלמות המבנה שלהם5. בהירות אפשרה ובכך לא רק ויזואליזציה, אלא גם הזדמנות דק לנתח רשתות הסלולר מורכבות מורפולוגיות רקמות ללא צורך חלוקתה.

כדי להשיג את סיווג רקמות, בהירות מעסיקה electrophoretic שיטות להסרת התוכן השומנים המדגם בהישג יד. בעוד בהירות נרשמה לייצור רקמות במצב יציב-הידרוג כלאיים, מחקרים הראו כי בזכות השימוש בשיטות ניקוי (וכו ‘) רקמת electrophoretic מפיקה את התוצאות משתנה מבחינת איכות לרקמות, לרבות, בראונינג, נזק epitope, ו איבוד חלבון5,6. כדי לטפל בבעיות אלה, ששונה פרוטוקולים כגון ברית (טכניקה פסיבי של בהירות), אשר מחליף את הטיפול וכד’ עם טכניקה הפסיבי, חומרי יוניים delipidation מבוסס, כבר מפותחת7,8,9. למרות השגת עקביות יותר תוצאות, עם זאת, ההסכם דורש יותר זמן כדי לקבל אישור מקסימלי. יתר על כן, אף אחת משיטות אלה טרם הוחלו את כל הטופס CNS או לפי דגמים גדולים מכרסמים כגון עכברים, שרקנים.

המחקר הנוכחי מבקשת להתייחס הגבלות אלה על-ידי מציע מתודולוגיות הרומן, psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), להקלה על פינוי מהיר של כל מערכת העצבים המרכזית ואיברים פנימיים מודלים גם העכבר וגם עכברוש10. באופן ספציפי, psPACT מעבד רקמות אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 בשני שלבים נפרדים במהלך היווצרות הידרוג; mPACT בעיקרו של דבר כרוך אותם שלבים, אבל תוספי תזונה פתרון סליקה מבוססי מרחביות עם 0.5% α-thioglycerol כמו מפתח תגובה כימית. בשתי הטכניקות לרתום את אנדוגני מערכתית cerebrospinal הדם ומערכות תפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי לייצר סיווג אופטי. מהווה הוכחה של עיקרון, נדגים את השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית לנתח כלי דם דפוסים רקמות שנוקה10.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מחקר מתאים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei. כל החיות ניסיוני מוקרבים בהתאם לקווים המנחים של הוועדה טיפול בבעלי חיים מעבדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei. 1. הכנת נוגדנים התראה: Paraformaldehyde (PFA), אקרילאמיד ו נתרן גופרתי dodecyl…

Representative Results

הדור של דגם שקוף של מערכת העצבים כל באמצעות טכניקות אופטימיזציה סליקה פסיבי סיווג אופטי של עכבר, חולדה רקמות CNS כל הושג במהירות תוך שימוש בטכניקות שונות סליקה פסיבי (איור 1). תיאור סכמטי של רקמות ניקוי במשך הזמן מו?…

Discussion

בעוד בשיטות חילוץ פאסיביים, שאינם electrophoretic המועסקים ברית לשפר באופן משמעותי את עקביות מושגת עם רקמת הקודם ניקוי שיטות כגון בהירות2,3,4,7 , 8, הטכניקה עדיין נושאת מספר חסרונות, הקשה ביותר של אשר הוא משך הז?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט המוח קוריאה 21 פלוס למדעי הרפואה, אוניברסיטת Yonsei. בנוסף, עבודה זו נתמכה על ידי מענק נבחרת מחקר קרן של קוריאה (ה-NRF-2017R1D1A1B03030315).

Materials

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix, Inc. 75819 Clearing solution
Nycodenz Axia-Shield 1002424 nRIMS solution
40% Acrylamide Solution Bio Rad Laboratories, Inc. 161-0140 Polymerization (A4P0)
2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 017-19362 Polymerization (VA-044)
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M1753-100ML Clearing solution (mPACT)
Tween-20 Georgiachem 9005-64-5 nRIMS solution
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML Immuno Staining
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSA100 Immuno Staining
Heparin Merck Millipore 375095 Perfusion (PBS)
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-25G nRIMS solution
PECAM-CD31 antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-28188 Immuno Staining
Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate Jackson ImmunoResearch Inc. 111-165-003 Immuno Staining
4% Paraformaldehyde Tech & Innovation BPP-9004 Perfusion, Polymerization
20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) Tech & Innovation BPB-9121 Perfusion, Buffer
10 mL stripette Coatar 4488 Solution transfer
50 mL tube Falcon 352070 Clearing tube
35 mm Cell culture dish SPL 20035 Imaging
Confocal dish SPL 211350 Imaging
1 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 26G 1/2 Anesthetize 
50 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 21G1 1/4 Perfusion
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 Polymerization (A4P0)
Whatman 3MM paper Sigma-Aldrich Z270849 Blotting paper for gel removal
Confocal microscope Zeiss LSM780 Imaging
ZEN lite Software Zeiss ZEN 2012 Imaging
Peristaltic pump Longerpump BT100-1F Perfusion
EasyGel Lifecanvas Technologies EasyGel Tissue gel hybridization system

References

  1. Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  4. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
  5. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
  6. Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
  7. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  8. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  9. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
  10. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  12. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  13. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  14. Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
  15. Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
  16. Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
  17. Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).

Play Video

Citer Cet Article
Woo, J., Lee, E. Y., Park, H., Park, J. Y., Cho, Y. E. Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue. J. Vis. Exp. (135), e57123, doi:10.3791/57123 (2018).

View Video