Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe
Summary
Hier stellen wir zwei neue Methoden, PsPACT und mPACT zur Erreichung maximaler optischer Transparenz und anschließende mikroskopische Analyse des Gewebes Gefäßsystem in das intakte Nagetier ganze CNS.
Abstract
Seit der Entwicklung von Klarheit ermöglicht ein Bioelectrochemical clearing-Technik, die für die dreidimensionale Phänotyp Zuordnung in den transparenten Geweben, eine Vielzahl von neuartigen Clearing Methoden einschließlich KUBISCH (klar, unverbaute bildgebenden Cocktails und computergestützte Analyse), SWITCH (systemweite Kontrolle der Interaktionszeit) und die Kinetik der Chemikalien, Karte (vergrößerte das Proteom-Analyse) und Pakt (passive Klarheit-Technik), eingerichtet, um das bestehende Instrumentarium für weiter ausbauen die mikroskopische Analyse von biologischen Geweben. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, bei der Verbesserung und Optimierung der ursprünglichen Pakt-Prozedur für ein Array intakt Nagetier Gewebe, einschließlich das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS), Nieren, Milz und ganze mausembryonen. PsPACT (Prozess-separater Pakt) und mPACT (“modifizierte Pakt”) bezeichnet, bieten diese neuartige Techniken hochwirksamen Mittel mapping Zelle Schaltung und subzelluläre Strukturen in intakten normalen und pathologischen Geweben zu visualisieren. Das folgende Protokoll bieten wir eine ausführliche, schrittweise Gliederung wie maximale Gewebe Abstand mit minimaler Invasion ihre strukturelle Integrität über PsPACT und mPACT zu erreichen.
Introduction
Ein grundlegendes Ziel der wissenschaftlichen und klinischen Untersuchung beinhaltet ein vollständiges Verständnis der Orgel Struktur und Funktion zu erreichen; die überaus komplexe Natur der Säugetier-Organe dient jedoch oft als Hindernis für voll und ganz diesem Ziel1zu erreichen. Klarheit (klare Lipid ausgetauscht Acrylamid-hybridisiert starre Imaging-kompatible Tisssue-hYdrogel)2,3,4, der beinhaltet den Aufbau einer Acrylamid-basierte Hydrogel-Hybrid von intakten Gewebe, erreicht optische Clearance von verschiedenen Organen, einschließlich Gehirn, Leber und Milz, unter Beibehaltung ihrer strukturellen Integrität-5. Klarheit konnte somit nicht nur die Visualisierung, sondern auch die Möglichkeit, komplexe Mobilfunknetze und Gewebe Morphologien ohne Schnitt fein sezieren.
Um Gewebe Abstand zu erreichen, setzt Klarheit elektrophoretische Methoden zum Entfernen von Lipidgehalt der Probe zur Verfügung. Während Klarheit gemerkt worden ist, für die Herstellung von physikalisch stabile Gewebe-Hydrogel Hybriden, Studien haben gezeigt, dass seine Verwendung der elektrophoretischen Gewebe Clearing (ETC) Methoden unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf Qualität Gewebe, einschließlich gebräunt, Epitop Schaden ergibt und Protein Verlust5,6. Um diese Probleme zu beheben, wurden modifizierte Protokolle wie Pakt (PAssive Technik, Klarheit), der die usw. Behandlung mit einer passiven, Ionische Spülmittel auf der Grundlage delipidierung-Technik ersetzt, entwickelten7,8,9. Trotz eine größere Konsistenz in Ergebnisse zu erreichen, erfordert jedoch Pakt mehr Zeit zum maximalen Abstand zu erhalten. Darüber hinaus wurden keine dieser Techniken noch auf das ganze CNS-Formular oder in größere Nager-Modelle wie Ratten und Meerschweinchen übernommen.
Die vorliegende Studie versucht, diese Einschränkungen zu beheben, indem er vorschlägt neuartige Methoden, PsPACT (“Prozess-separater Pakt”) und mPACT (modifizierte Pakt), für erleichtern die schnelle Abfertigung von die ganze CNS und inneren Organe bei Maus und Ratte Modelle10. Im einzelnen verarbeitet PsPACT Gewebe in 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 in zwei getrennten Schritten während Hydrogel Bildung; mPACT im Wesentlichen die gleichen Schritte beinhaltet, sondern ergänzt die SDS-basierte Clearing-Lösung mit 0,5 % α-Thioglycerol als zentrale Reagens. Beide Techniken nutzen die endogenen systemische und Liquor Kreislaufsystem um den Zeitaufwand zum optischen Freiraum produzieren deutlich zu reduzieren. Als Beweis des Prinzips zeigen wir den Einsatz der konfokalen Mikroskopie, Blutgefäß-Muster in den geräumten Gewebe10zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während die passive, nicht elektrophoretischen Extraktionsmethoden beschäftigt verbessert Pakt deutlich die Konsistenz erreicht mit früheren Gewebe clearing-Methoden wie Klarheit2,3,4,7 , 8, trägt die Technik noch mehrere Mängel auf, die dringendsten davon die Länge der Zeit benötigt, um maximale Gewebe Klarheit12zu erreichen ist…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Gehirn Korea 21 PLUS Projekt für die medizinische Wissenschaft, Yonsei Universität unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315) unterstützt.
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
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