Summary

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Published: January 30, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל נתונים smFRET תלת-צבעי וניתוח שלה עם אנסמבל תלת-ממד מודל מרקוב חבוי. מתוך תפיסה זו, מדענים יכולים לחלץ מידע קינטי מערכות חלבונים מורכבים, כולל cooperativity או אינטראקציות מתואם.

Abstract

העברת אנרגיה תהודה של מולקולה בודדת פורסטר (smFRET) הפך טכניקה biophysical בשימוש נרחב כדי ללמוד את הדינמיקה של מולקולות. עבור רבים למכונות המולקולריות בחלבונים התא יש לפעול יחד עם שותפים אינטראקציה במחזור תפקודית כדי למלא את המשימה שלהם. ההרחבה של שני צבעים לצבע מרובה smFRET מאפשר לחקור בו זמנית אינטראקציה אחד או יותר או לשינוי הסתגלותי. זה לא רק מוסיף מימד חדש ניסויים smFRET אך גם מציעה את האפשרות ייחודי ללמוד ישירות רצף האירועים כדי לזהות אינטראקציות מתואם כאשר באמצעות דוגמה קיבוע פלורסצנטיות החזרה גמורה מיקרוסקופ (TIRFM). לכן, צבע רב smFRET הוא כלי רב-תכליתי ללמוד למערכות ביולוגיות מתחמי באופן כמותי, בפירוט שעצם בעבר.

כאן, אנחנו מדגימים כיצד להתגבר על האתגרים המיוחדים של צבע רב smFRET ניסויים על חלבונים. אנו מציגים נתונים היסטוריים פרוטוקולים להשגת הנתונים, לחילוץ מידע קינטי. זה כולל מעקב קריטריוני הבחירה מהמדינה, ההתאוששות של המדינה מסלולים מתוך נתוני רעש באמצעות אנסמבל תלת-ממד של מודל מרקוב חבוי (הממ). לעומת שיטות אחרות, המידע קינטי לא החלים להתעכב זמן היסטוגרמות אלא ישירות מאת הממ. המסגרת נראות מקסימלית מאפשר לנו להעריך באופן ביקורתי את מודל קינטי וכדי לספק אי ודאות משמעותיים על המחירים.

על-ידי החלת שיטת שלנו החלבון הלם חום 90 (Hsp90), אנו מסוגלים disentangle האיגוד נוקלאוטיד והשינויים הסתגלותי הכללית של החלבון. זה מאפשר לנו לצפות ישירות את cooperativity בין איגוד נוקלאוטיד שני הכיסים של דיימר Hsp90.

Introduction

חלבונים רבים ממלאים תפקידם במתחמי דינמי עם מולקולות אחרות, מתווכת על-ידי שינויים הסתגלותי ואגודות ארעי על מגוון רחב של צירי זמן-1,2,3. מצמידים חיצוני כמקור אנרגיה (למשל, ATP) אינטראקציות דינמי אלה יכולים להוביל כיוון במחזור פונקציונלי ולתחזק בסופו של דבר ללא שיווי משקל היציב-המדינה בתא, תנאי מוקדם לכל החיים.

כדי להבין באופן מלא את מכונות מולקולריות אלה, תיאור סטטי מודרכת על ידי מחקרים מבניים אינה מספיקה. בנוסף, זה חיוני לא ידע קינטי מהמודל המשמש כבסיס וכדי לקבוע את קבועי קצב קינטי. קיימות מספר שיטות לאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של האינטראקציות בינארית בין שתי מולקולות של עניין, למשל, פני השטח פלזמון תהודה, שיטות הרפיה עם הבדיקה ספקטרוסקופיות (למשל, קפיצה או זרימה עצר טכניקות), ותהודה מגנטית גרעינית. אולם, ישימות שלהם הוא ברוב המקרים מוגבל שתי המדינות מערכות פשוטות (למשל, אחד מאוגד, מדינה לא מאוגד) עקב בממוצע הטמון בניסויים בצובר. במקרים שבהם מעורבים יותר מדינות או intermediates, הן מפיקות רק תערובת מורכבת של הקבועים קצב. מולקולה בודדת שיטות כגון פינצטה אופטית או מגנטי או smFRET שני צבעים, קרי, תורם אחד אחד מקבל fluorophore, עם דגימת משטח. מרותק למיטה יכול לשחזר את קבועי קצב לכל נצפו שינויים הסתגלותי. אולם, כשמדובר אינטראקציות המשפיעים על אתר קישור אחד או יותר, שיטות אלה נשארים מוגבל, המידע לאינטראקציות מתאם אפשרי של השניים (או יותר) רק יהיה נגיש דרך עקיפה מסקנות ערכה של ניסויים.

צבע רב smFRET4,5,6,7,8,9 מציע הזדמנות ללמוד את האינטראקציה בין רכיבים אלה באופן ישיר, בזמן אמת, תחת תנאים ליד-פיזיולוגיים10. זה מתיר אחד לחקור לדוגמה, הכריכה תלויי-קונפורמציה של ליגנד או חלבון אחר8,9,11. הגישה הכללית המובאת כאן היא לסמן את protein(s) של עניין-עמדות מסוימות, כדי לצרף חלבון אחד על פני השטח של התא מדידה, וכדי לעקוב אחר עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן על TIRFM פריזמה-סוג (עבור פרטים ראה 9 , 12). הקרבה המרחבי של צבעים שונים ואז יכול להיקבע מתוך העברת האנרגיה ביניהם. תיוג אסטרטגיות עשויים להשתנות מחלבון לחלבון (נבדקה 13), קווים מנחים כדי להימנע חפצים במדידות smFRET קיימים14.

מאז צבע התורם יכול להעביר אנרגיה שונה מקבל צבע בניסוי צבע רב smFRET, המיקום היחסי של כל צבעי אינו נגיש של עירור של צבע אחד לבד15,16. אבל בשילוב עם מתחלפים עירור לייזר (אלכס17, ו שנסקרה ב 18) שיטה זו מספקת את כל המידע-עתיים-פחות משנייה והרזולוציה תת ננומטר.

המנהל, נתוני מבנה יכולה להיות מושגת על ידי שימוש של המרחקים בין צבע ברזולוציה גבוהה מחושב משילוב של כל עוצמות קרינה פלואורסצנטית בניסוי צבע רב smFRET עם אלכס. עם זאת, כאן אנו מתמקדים זיהוי מצב, הפרדה, כמו גם הפקת מודלים קינטי, שבו צבע רב smFRET היא הכרחית. כאשר “רק” מבנה נחישות על ידי טריאנגולציה היא הרצויה, ערכת ניסויים פשוטים smFRET שני צבעים עם יחס אות לרעש גבוה יכול להיות בביצוע12,19.

אנו משתמשים על ידי קרינה פלואורסצנטית חלקית (Equation 1) כמדד להעברת אנרגיה בין שני fluorophores7. PF מחושבת על פי עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקביל היעילות סריג של ניסוי שני צבעים:

Equation 2

איפה, Equation 3 הוא עוצמת ב פליטה ערוץ em לאחר עירור עם צבע לשעברו- c הוא מקבל עם אורך הגל הארוך ביותר. זיהוי ערוצי מייצגים באותה התנוחה לדוגמה קאמרית, אבל הרשומה טווחי האור פלורסצנטיות ספקטרלי שונים. אותו מזהה עירור, פליטה נמצאים בשימוש פרוטוקול זה (קרי, “כחול”, “ירוק” או “אדום”).

בגלל חסרונות ניסיוני עוצמות קרינה פלואורסצנטית נמדד תלויים לא רק על העברת אנרגיה, אלא גם על מאפייני fluorophore וההתקנה. על מנת להשיג את יעילות העברת אנרגיה אמיתית בין שתי fluorophores, עוצמות נמדד צריך לתקן. ההליך הבא מבוסס על התייחסות9. גורמים תיקון דליפה נראית לעין (lk, קרי, הגילוי של פוטונים מ fluorophore בערוץ המיועד צבע אחר), גאמה נראית לעין (ag, קרי, התשואה קוונטית זריחה של לצבוע את זיהוי יעילות של הערוץ) מתקבלים מן עקבות מולקולה בודדת המציגים מקבל של הלבנת אירוע.

דליפת לצבוע התורם לתוך בכל ערוץ אפשרי מקבל מחושבת על פי כל נקודות נתונים עקבות קרינה פלואורסצנטית מוקלט שבו מקבל לצבוע מולבן אך התורם הוא עדיין פלורסנט (Equation 4):

Equation 5

החציון של ההיסטוגרמה זליגת משמש כגורם זליגת נראית לעין. לאחר תיקון עבור דליפה, הגורם גמא לכאורה נקבע מתוך אותה קבוצה של עקבות. הוא מחושב על ידי חלוקת השינוי של קרינה פלואורסצנטית בערוץ מקבל על ידי השינוי של קרינה פלואורסצנטית בערוץ התורם על הלבנה של לצבוע מקבל:

Equation 6

כאשר c הוא שוב בערוץ זיהוי עבור מקבל עם אורך הגל הארוך ביותר. החציון של ההתפלגות וכתוצאה מכך משמש פקטור התיקון נראית לעין.

עוצמות המתוקן בכל אחד מהערוצים מתקבלים על ידי:

Equation 7

PF לאחר מכן מחושב על פי:

Equation 8

ניתן להפריד בין אוכלוסיות שונות במרחב רב ממדית שמקיפות את s PF. המיקום ואת הרוחב של כל מדינה נקבע על ידי התאמת הנתונים עם פונקציות גאוסיאנית רב-מימדי. אופטימיזציה עוקבות של אחד הממ גלובלית המבוססת על כל עקבות PF מספק תיאור כמותי של קינטיקה התצפיות. אפילו שינויים קטנים של התעריפים הן לזיהוי.

HMMs מספקים דרך של אומדן משוער מודל המדינה מאוסף של עקבות הזמן רועש. המערכת נחשבת באחד ערכה של בדידה, הברית מוסתרים בכל זמן נתון, התצפית בפועל (קרי, הפליטה) היא פונקציה הסתברותית של המדינה מוסתרים20. במקרה של נתונים smFRET TIRFM, פליטת הסתברויות bאני לכל המדינה אני שניתן למדל באמצעות פונקציות צפיפות ההסתברות גאוסיאנית רציפה. בנקודות זמן בדידים מפוזרים באופן קבוע, מעברים מאחד למדינה אחרת יכולה להתרחש לפי ההסתברות מעבר הזמן-שמורה, רק תלויה במצב הנוכחי. המטריקס המעבר A מכיל אלה הסתברות המעבר ij בין כל המדינות מוסתרים. התפלגות המצב ההתחלתי של Equation 9 נותן ההסתברויות ספציפיים- Equation 10 לנקודה בפעם הראשונה של עקבות הזמן. שימוש בגישה מרבי-הסבירות, פרמטרים אלה ניתן למטב בצורה הטובה ביותר לתאר את הנתונים עם קדימה-אחורה, באום-ולש אלגוריתמים20,21. זה מניב את estimators נראות מקסימלית (MLE). לבסוף, שניתן להסיק על רצף מצב סביר הפיק את המסלול של תצפיות עם אלגוריתם ויטרבי. בניגוד אחרים ניתוחים הממ של smFRET נתונים24,25,26 אנחנו לא משתמשים את הממ כמו גרידא “החלקה” של נתונים אבל תמצית המודל המדינה קינטי של ערכת הנתונים ללא הצורך עבור התאמת זמן להתעכב היסטוגרמות27. ניתוח הממ מתבצעת באמצעות קבצי script ללא צורך במיקור חוץ באמצעות איגור Pro. הטמעת הקוד מבוסס על התייחסות21. אנו מספקים ערכת תוכנה ונתונים למופת בדף שלנו לעקוב סעיפים 5 ו- 6 של פרוטוקול זה, (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). תוכנה מלא הינו זמין על פי בקשה.

נקודות הנתונים עם PF זמן <-1 או PF > 2 בערוץ כל זיהוי מוקצים ההסתברות פליטה מינימלית על כל המדינות (10-200). פעולה זו מונעת מעברים מלאכותי בנקודות אלו נתונים.

הפרמטרים עבור ההסתברויות פליטה מתקבלים מן ההתאמה של ההיסטוגרמה PF 3D עם פונקציות לפי עקומת גאוס, כפי שמתואר בשלב 5.7. פרמטרים אלה נשמרים קבועים במהלך אופטימיזציה של הממ.

הגישה שהוצגו, הווקטור הפצה המצב ההתחלתי של המטריקס המעבר משמשים באופן גלובלי לתאר את ההרכב כולו עקבות. והם מתעדכנים בהתבסס על כל N מולקולות של ערכת הנתונים על פי הפניה27.

התחל פרמטרים עבור התפלגות המצב ההתחלתי נקבעים מתוך תחזיות דו-מימדית של ההיסטוגרמה PF (שלב 5.3) ולא ההסתברויות המעבר מוגדרות כ 0.05 למעט ההסתברויות כדי להישאר באותו המצב, אשר נבחרו כך כי ההסתברות לעזוב את מצב מסוים מנורמל לאחדות.

שיטה פרופיל הסבירות משמש כדי לתת מרווחי ביטחון (CIs) עבור כל המעבר המחירים21,22, אשר לשמש הערכות משמעותי עבור חוסר הבהירות. לחישוב גבולות של המודיע על שיעור מסוים, ההסתברות המעבר של ריבית קבוע בערך השונה MLE. זה מניב את λ דגם המבחן ‘. מבחן הסבירות יחס (LR) הסבירות Equation 16 בהתחשב ערכת הנתונים 0 מתבצע על פי:

Equation 11

ביטחון 95% המאוגד עבור הפרמטר הוא הגיע כאשר LR חורג 3.841, quantile 95% של x2-התפלגות עם דרגת חופש אחת22,23.

כוחה של השיטה הוא הפגין באמצעות של Hsp90. החלבון בשפע זה נמצא ב חיידקים וב פרוקריוטים והוא חלק תגובת לחץ הסלולר28. זה מטרה סמים מבטיח טיפול בסרטן29. Hsp90 הוא homodimer עם כיס כריכה נוקלאוטיד בתחום N-מסוף של כל יחידה משנית30. זה יכול לעבור במעברים בין לפחות שני הייצורים החיים באופן גלובלי מובהק, אחד סגור,31,19,פתוח, בצורת V קונפורמציה N-מסוף אחד32. הטבע dimeric ישירות מעלה את השאלה של יחסי הגומלין בין האתרים מחייב נוקלאוטיד שני ב- Hsp90.

בחלק זה, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור רכישת נתונים וניתוח של ניסוי smFRET תלת-צבעי על שמרים Hsp90, נוקלאוטיד. הכריכה תלויי-קונפורמציה של המגבר-PNP שכותרתו fluorescently (AMP-PNP *, אנלוגים הלא-hydrolyzable ATP) ניתוח. היישום של ההליך המתואר היתרים המחקר של האיגוד נוקלאוטיד ו באותו הזמן את השינויים הסתגלותי של Hsp90, ובכך חושף את cooperativity בין איגוד נוקלאוטיד שני הכיסים של Hsp90.

Protocol

1. התקנה ותנאים מוקדמים מבצע המדידות צבע רב smFRET TIRFM מנסרה-סוג. תיאור של מלכודת שני צבעים כמו פרסום יופיטר ניתנת התייחסות12. בנו של TIRFM צבע רב. פריסה כללי מפורט ב 9. השימוש להחלפה, דיודה שאוב לייזרים רציפה wave מצב מוצק, ההופכים את השימוש תריסים מכני בנתיבי…

Representative Results

צבע רב smFRET המידות לאפשר זיהוי ישיר קורלציה בין שניים או יותר אתרים אינטראקציה ברורים. זה הופך את הטכניקה הייחודית לחקור מערכות רכיבים מרובים, כגון חלבון מתחמי. אנו מתמקדים המצגת של smFRET תלת-צבעי ניסוי כאן, אשר משמש דוגמה להמחשה. תהליך העבוד…

Discussion

אנו מציגים בהליך ניסיוני להשיג smFRET תלת-צבעי נתונים עבור מערכת חלבונים מורכבים, תיאור שלב אחר שלב של הניתוח של מדידות אלה. גישה זו מציעה את האפשרות ייחודי להעריך ישירות המתאם בין מספר אתרים אינטראקציה או שינויים הסתגלותי.

על מנת לקבל נתונים יחיד מולקולה צבע רב מתאימים חלבוני…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו ממומן על ידי קרן מחקר גרמני (מוסד 39/969-1), המועצה האירופית למחקר באמצעות הסכם גרנט ERC 681891 (ש. ע.)..

Materials

Setup
vibration-damped optical table   Newport, Irvine, CA, USA RS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASER Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1196625
laser control unit Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA 1234465 Scientific Remote
aspheric telescope lenses Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA d=25.4mm, f=50mm and f=100mm
CF ex1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZET 473/10 cleanup filter excitation
CF ex2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZET 532/10 cleanup filter excitation
CF ex3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZET 594/10 cleanup filter excitation
CF ex4 Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA FL635-10 cleanup filter excitation
DM ex1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZQ594RDC dichroic mirror excitation
DM ex2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 570DCXR dichroic mirror excitation
DM ex3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany ZQ491RDC dichroic mirror excitation
AOTFnC-Vis AA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 plate Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA AQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100x Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA high-NA objective
piezo focus positioner MIPOS 250 CAP piezosystem jena GmbH, Jena, Germany Piezo Controller NV 40/1 CLE
piezo stepper Newport, Irvine, CA, USA PZA12 PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit
achromatic aspheric lenses Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany G322-304-000 d=50mm, f=200mm
adjustable optical slit Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany 27.160.1212 max. aperture 12 x 12 mm
DM det1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany T 600 LPXR dichroic mirror detection
DM det2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany H 560 LPXR superflat dichroic mirror detection
DM det3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany HC BS R635 dichroic mirror detection
BP det1 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 525/40 BrightLine HC bandpass filter detection
BP det2 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 586/20 BrightLine HC bandpass filter detection
BP det3 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 631/36 BrightLine HC bandpass filter detection
BP det4 AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany 700/75 ET Bandpass bandpass filter detection
optical shutters detection Vincent Associates, Rochester, NY, USA Uniblitz VS25S2T0 
EMCCD iXon Ultra 897 Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
digital I/O card, PCIe-6535 National Instruments, Austin, Texas, USA
syringe pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD22/2000
Name Company Catalog Number Comments
Flow chamber
quartz slides G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA Spectrosil2000, h=3mm
TEGADERM film 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany 1626W 10 x 12cm
spray adhesive 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany Photo Mount 050777
glycerol Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany Immersol G
immersion oil OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany IMMOIL-F30CC
prism Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany Suprasil1
aluminium prism holder custom built
hollow setscrews Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA with custom drilling
Tygon S3 E-3603 tubing neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany 2-4450 ACF00001
PTFE tubing Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany S1810-08
Name Company Catalog Number Comments
Sample
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin UniProt ID P02829
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550 ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP* Jena Bioscience, Jena, Germany γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
Fluospheres Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA F8764 amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent
Name Company Catalog Number Comments
Software
Andor Solis Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland version 4.30
LabVIEW National Instruments, Austin, Texas, USA version 2012, 32bit; misc. hardware control
MDS control software AA Opto-Electronic, Orsay, France version 2.03a
Coherent Connection Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA version 3
Igor Pro WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA version 6.37

References

  1. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Hohng, S., Joo, C., Ha, T. Single-Molecule Three-Color FRET. Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).
  5. Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
  6. Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. Single-molecule four-color FRET. Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).
  7. Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90’s mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
  8. Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192 (2014).
  9. Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
  10. Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
  11. Wortmann,P , ., Götz M, ., Hugel T , . Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
  12. Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782 (2017).
  13. Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
  14. Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
  15. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  16. Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
  17. Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  18. Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
  19. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
  20. Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
  21. Fink, G. A. . Markov Models for Pattern Recognition. , (2014).
  22. Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
  23. Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
  24. McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
  25. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  26. Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).
  27. Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
  28. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
  29. Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
  30. Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
  31. Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
  32. Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
  33. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  34. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  35. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  36. Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
  37. Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
  38. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  39. Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  40. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).

Play Video

Citer Cet Article
Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions. J. Vis. Exp. (131), e56896, doi:10.3791/56896 (2018).

View Video