Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Viele Proteine erfüllen ihre Funktion in dynamische komplexe mit anderen Molekülen, vermittelt durch Konformationsänderungen und transiente Verbände auf ein breites Spektrum von zeitlichen^1,2,3. Gekoppelt an eine externe Energiequelle (z. B. ATP) diese dynamische Interaktionen zu Direktionalität in einem funktionalen Kreislauf führen und letztlich nicht-Gleichgewichts-stationären in eine Zelle, die Voraussetzung für das Leben zu erhalten.

Um diese molekularen Maschinen zu verstehen, ist eine statische Beschreibung geführt durch strukturelle Studien nicht ausreichend. Darüber hinaus ist es wichtig, Kenntnisse der zugrunde liegenden kinetischen Modell haben und die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten bestimmen. Mehrere vorhandene Methoden können Forscher die Dynamik der binäre Interaktionen zwischen zwei Molekülen von Interesse, z. B. Oberflächenplasmonenresonanz, Entspannungsmethoden mit einer spektroskopischen Anzeige (z. B. Sprung oder gestoppt-Flow zu studieren Techniken) und magnetischen Kernresonanz. Ihre Anwendbarkeit ist jedoch in den meisten Fällen beschränkt auf einfache zwei-Staaten-Systeme (z. B. einer gebundenen und einer ungebundenen Zustand) durch die Mittelung in loser Schüttung Experimente. In Fällen wo mehrere Staaten oder Zwischenprodukte beteiligt sind, führen sie nur eine komplexe Mischung aus der Geschwindigkeitskonstanten. Einzelmolekül-Methoden wie optische oder magnetische Pinzette oder Zweifarben-SmFRET, d. h. eine Spenderin und einem Akzeptor Fluorophor, mit einer Oberfläche immobilisiert Probe können die Geschwindigkeitskonstanten für alle beobachteten Konformationsänderungen wiederherstellen. Allerdings geht es um Interaktionen beeinflussen mehr als eine Bindungsstelle, diese Methoden beschränkt bleiben und die Informationen über die mögliche Korrelation der beiden (oder mehr) Wechselwirkungen werden nur über indirekte Schlussfolgerungen aus einer Reihe von Experimenten.

Multi-Color-SmFRET^4,5,6,7,8,9 bietet die Möglichkeit, das Zusammenspiel dieser Komponenten direkt in Echtzeit und unter studieren in der Nähe von physiologischen Bedingungen¹⁰. Dies erlaubt zum Beispiel die Konformation-abhängige Bindung eines Liganden oder ein anderes Protein^8,9,11untersuchen. Das hier vorgestellte Gesamtkonzept ist benutzt von Interesse an bestimmten Positionen, ein Protein auf der Oberfläche der Messkammer zu befestigen und die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit auf ein Prisma-Typ TIRFM (für Details siehe ⁹ verfolgen beschriften ^{, 12}). die räumliche Nähe der verschiedenen Farbstoffe kann dann aus der Energieübertragung zwischen ihnen ermittelt werden. Kennzeichnung Strategien von Protein zu Protein (rezensiert in ¹³) abweichen und Richtlinien, um Artefakte in SmFRET Messungen zu vermeiden gibt es¹⁴.

Da ein Spender-Farbstoff zu verschiedenen Akzeptor Farbstoffe in einem Multi-Color-SmFRET-Experiment Energie übertragen kann, ist die relative Position der alle Farbstoffe nicht Erregung einen Farbstoff allein^15,16erreichbar. Aber in Kombination mit abwechselnden Laseranregung (ALEX¹⁷und bewertete in ¹⁸) bietet diese Methode alle räumlich-zeitliche Informationen bei unter einer Sekunde und Sub-Nanometer Auflösung.

Im Prinzip hochauflösende strukturelle Informationen erreicht werden kann, mithilfe der Inter Farbstoff Entfernungen berechnet aus der Kombination aller Fluoreszenz-Intensitäten in einem Multi-Color-SmFRET-Experiment mit ALEX. Aber, hier konzentrieren wir uns auf staatliche Identifizierung und Trennung sowie die Gewinnung von kinetische Modelle, wo Multi-Color SmFRET unerlässlich ist. Wenn “nur” Strukturaufklärung durch Triangulation gewünscht wird, kann eine Reihe einfacher Zweifarben-SmFRET-Experimente mit hohen Signal-Rausch-Verhältnis durchgeführten^12,19.

Wir verwenden teilweise Fluoreszenz () als Proxy für die Energieübertragung zwischen zwei Fluorophore⁷. Die PF errechnet sich aus der Fluoreszenzintensität analog zu der FRET-Effizienz eines zwei-Farben-Experiments:

Wo, ist die Intensität in Emission Kanal Em nach Anregung mit Farbe abund c ist der Akzeptor mit der längsten Wellenlänge. Erkennung-Kanäle stellen die gleiche Position in der Probenkammer aber erfassen unterschiedliche Spektralbereiche des Lichts Fluoreszenz dar. Der gleiche Bezeichner für Anregung und Emission werden in diesem Protokoll verwendet (z.B. “blau”, “grün” und “rot”).

Aufgrund experimenteller Mängel hängen die gemessenen Fluoreszenz-Intensitäten nicht nur auf die Energieübertragung, sondern auch von Fluorophor und Setup-Eigenschaften. Um die wahre Energieeffizienz der Übertragung zwischen zwei Fluorophore zu erhalten, müssen die gemessenen Intensitäten korrigiert werden. Die folgende Prozedur basiert auf Referenz⁹. Korrekturfaktoren für scheinbare Leckage (lk, d. h. der Nachweis von Photonen aus einem Fluorophor in einem Kanal für ein anderer Farbstoff bezeichnet) und scheinbare Gamma (ag, d. h. die Quantenausbeute der Fluoreszenz des Farbstoffes und die Nachweiseffizienz des Kanals) stammen aus Einzelmolekül-Spuren, die ein Akzeptor bleichen Veranstaltung zeigen.

Das Austreten von der Spender-Farbstoff in jeden möglichen Akzeptor-Kanal errechnet sich aus alle Datenpunkte in der aufgezeichneten Fluoreszenz Spuren wo der Akzeptor Farbstoff gebleicht aber der Spender ist noch fluoreszierende ():

Der Median des Histogramms Leckage dient als scheinbare Leckage Faktor. Nach der Korrektur auf Dichtheit richtet sich der scheinbare Gammafaktor aus den gleichen Satz von Spuren. Es wird ermittelt, indem die Änderung der Fluoreszenz in den Akzeptor-Kanal durch die Änderung der Fluoreszenz in der Geber-Kanal beim Bleichen von der Akzeptor Farbstoff:

Wobei c wieder die Erkennung Kanal für den Akzeptor mit der längsten Wellenlänge ist. Der Median der daraus resultierenden Verteilung wird als die scheinbare Korrekturfaktor verwendet.

Die korrigierten Intensitäten in jedem Kanal stammen von:

PF wird dann entsprechend berechnet:

Verschiedene Populationen können in der multi-dimensionalen Raum erstreckte sich von der PFs getrennt werden. Die Position und Breite der einzelnen Staaten wird durch Anpassung der Daten mit multi-dimensionalen Gaußsche Funktionen bestimmt. Anschließende Optimierung von einem globalen HMM basierend auf alle PF -Spuren bietet eine quantitative Beschreibung der beobachteten Kinetik. Selbst kleine Änderungen der Preise sind nachweisbar.

Hmm bieten eine Möglichkeit der Ableitung ein Zustandsmodell aus einer Sammlung von lauten Zeitspuren. Das System wird als in einem der eine Reihe von diskreten, versteckten Staaten an einem bestimmten Zeitpunkt und die tatsächliche Beobachtung (d. h. die Emission) ist eine probabilistische Funktion von diesem Status “verborgen”²⁰. Bei TIRFM SmFRET Daten kann die Emission Wahrscheinlichkeiten b_ich pro Staat ich durch kontinuierliche “glockenförmig” Wahrscheinlichkeitsdichte Funktionen modelliert werden. Zu regelmäßigen Abständen diskreten Zeitpunkten können Übergänge von einem in einen anderen Staat nach dem Übergang Wahrscheinlichkeit auftreten, die Zeit-invariante und hängt nur von den aktuellen Zustand. Der Übergangsmatrix A enthält diesen Übergang Wahrscheinlichkeiten einer_Ij zwischen allen versteckten Staaten. Der Ausgangszustand Verteilung gibt die bundeslandspezifischen Wahrscheinlichkeiten für den ersten Zeitpunkt der Zeit spurlos. Mit einem Maximum-Likelihood-Ansatz, können dieser Parameter optimiert werden, um die Daten mit der vorwärts-rückwärts und Baum-Welch Algorithmen^20,21am besten beschreiben. Daraus ergibt sich die maximum-Likelihood-Schätzer (MLE). Schließlich kann der Staat-Sequenz, die höchstwahrscheinlich die Flugbahn des Beobachtungen produziert mit dem Viterbi-Algorithmus abgeleitet werden. Im Gegensatz zu anderen HMM Analysen von SmFRET Daten^24,25,26 verwenden wir keine HMM als eine bloße “Glättung” der Daten, sondern die kinetische Staatsmodell Extrakt aus dem Datensatz ohne die Notwendigkeit für den Einbau Verweilzeit Histogramme²⁷. HMM die Auswertung erfolgt mit eigenen Skripten mit Igor Pro. Umsetzung des Kodex basiert auf Referenz²¹. Wir bieten eine Softwarekit und beispielhafte Daten auf unserer Webseite um Abschnitte 5 und 6 dieses Protokolls (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) folgen. Vollständige Software ist auf Anfrage erhältlich.

Zeitpunkten in den Daten mit PF <-1 oder PF > 2 in jedem Kanal Erkennung sind die minimale Emission Wahrscheinlichkeit für alle Staaten (10^-200) zugeordnet. Dies verhindert, dass künstliche Übergänge an diese Datenpunkte.

Die Passform des 3D PF Histogramms mit Gaußsche Funktionen werden die Parameter für die Emission Wahrscheinlichkeiten entnommen, wie im Schritt 5.7 beschrieben. Diese Parameter werden bei der Optimierung der HMM fest gehalten.

Des vorgestellten Ansatzes dienen der Ausgangszustand Verteilung Vektor und die Übergangsmatrix weltweit, das gesamte Ensemble der Spuren zu beschreiben. Sie werden aktualisiert, basierend auf alle N Moleküle aus dem Datensatz nach Verweis²⁷.

Startparameter für den Anfangszustand Vertrieb aus 2D Projektionen des Histogramms PF (Schritt 5.3) ermittelt und die Übergangswahrscheinlichkeiten werden sich voraussichtlich auf 0,05 mit Ausnahme der Wahrscheinlichkeiten bleiben im gleichen Zustand, die solche ausgewählt werden dass die Wahrscheinlichkeit, einen bestimmten Zustand zu verlassen zur Einheit normalisiert.

Ein Wahrscheinlichkeit Profiler-Methode dient zur Konfidenzintervalle (CIs) für alle Übergang Preise^21,22, dienen als sinnvolle Schätzungen für ihre Unsicherheit zu geben. Um die Grenzen der CI zu einem bestimmten Preis zu berechnen, ist die Wahrscheinlichkeit Übergang von Interesse auf einen anderen Wert als die MLE fixiert. Daraus ergibt sich die Test-Modell λ “. Eine Wahrscheinlichkeit-Verhältnis (LR) Test der Wahrscheinlichkeit angesichts des Datensatzes erfolgt nach 0 :

Das 95 %-Konfidenzintervall gebunden für der Parameter erreicht ist, überschreitet LR 3.841, das 95 %-Quantil der ein x²-Verteilung mit einem Freiheitsgrad^22,23.

Die Macht der Methode wird unter Verwendung der Hsp90 demonstriert. Dieses reichliche Protein findet sich in Bakterien und Eukaryoten und ist Bestandteil der zellulären Stress-Reaktion-²⁸. Es ist ein viel versprechendes Medikament Ziel in Krebs Behandlung²⁹. Hsp90 ist ein Homodimer mit einem Nukleotid-Bindungstasche in die N-terminale Domäne von jeder Untereinheit³⁰. Es kann Übergänge zwischen mindestens zwei weltweit unterschiedliche Konformationen, geschlossen und eine N-terminale offen, v-förmige Konformation^19,31,32unterziehen. Die dimeres Natur Frage direkt die des Zusammenspiels zwischen die zwei Nukleotid-Bindungsstellen im Hsp90.

Im folgenden bieten wir eine Schritt für Schritt-Protokoll für die Datenerfassung und Analyse einer dreifarbigen SmFRET Experiment auf Hefe Hsp90 und Nukleotid. Die Konformation-abhängige Bindung von Eindringmittel beschrifteten AMP-PNP (AMP-PNP *, ein nicht-hydrolysierbare Analogon von ATP) wird analysiert. Die Anwendung des beschriebenen Verfahrens erlaubt der Studie der Nukleotid-Bindung und zur gleichen Zeit die Konformationsänderungen Hsp90 und zeigt damit die Kooperativität zwischen den zwei Nukleotid verbindliche Taschen von Hsp90.