Este protocolo estuda o papel do ligante de chemokine (C-C motif) 5 (CCL5) no hipotálamo, entregando um antagonista, MetCCL5, dentro do cérebro de rato usando um sistema de infusão de cérebro de bomba micro-osmótica. Esta inibição transitória de CCL5 atividade interrompida hipotalâmica insulina sinalização, levando à intolerância à glicose e a sensibilidade periférica à insulina sistêmica.
Insulina regula o metabolismo sistemático no hipotálamo e a resposta de insulina periférica. Uma reacção inflamatória nos tecidos adiposos periféricos contribui para o desenvolvimento de diabetes mellitus (T2DM) tipo 2 e regulação de apetite no hipotálamo. Receptor do chemokine Chemokine CCL5 e C-C tipo 5 (CCR5) níveis têm sido sugeridos para mediar a arteriosclerose e glicose intolerância na diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Além disso, CCL5 desempenha um papel neuroendócrino no hipotálamo regulando comida ingestão e a temperatura corporal, assim, levando-na investigar a sua função na sinalização da insulina hipotalâmica e regulação do metabolismo da glicose periférica.
O sistema de infusão de cérebro micro-osmótica bomba é uma maneira rápida e precisa para manipular CCL5 função e estudar o seu efeito no cérebro. Ele também fornece uma abordagem alternativa conveniente para gerar um animal transgénico nocaute. Neste sistema, CCL5 sinalização foi bloqueada por infusão intracerebroventricular (ICV) seu antagonista, MetCCL5, usando uma bomba de micro-osmótica. A capacidade de resposta metabolismo e insulina glicose periférica foi detectada pelo teste de tolerância de glicose Oral (OGTT) e teste de tolerância a insulina (ITT). Atividade de sinalização de insulina então foi analisada pela mancha de proteínas de amostras de tecido derivado de animais.
Depois de 7-14 dias de infusão MetCCL5, o metabolismo da glicose e insulina receptividade foi prejudicada em ratos, como pode ser visto nos resultados do OGTT e ITT. A fosforilação de serine302 do IRS-1 foi aumentada e a atividade de Akt reduziu-se em neurônios hipotálamo de ratos seguindo CCL5 inibição. No total, nossos dados sugerem que bloquear CCL5 no cérebro do rato aumenta a fosforilação do IRS-1 S302 e interrompe a sinalização hipotalâmica insulina, levando a uma diminuição da função da insulina em tecidos periféricos, bem como a deficiência de glicose metabolismo.
Insulina afeta uma ampla variedade de tecidos, incluindo o cérebro. Insulina atravessa a barreira hemato – encefálica, entra no sistema nervoso central (SNC) e vincula-se com o receptor de insulina (IR) no hipotálamo para regular a ingestão de alimentos, atividade simpática e resposta periférica da insulina. Inflamação crônica nos tecidos adiposos periféricos tem sido proposta para contribuir para o tipo 2 diabetes mellitus (T2DM), mas como estas reações inflamatórias afetam a insulina sinaliza no hipotálamo para mediar insulina sistêmica resposta e glicose intolerância Ainda não está claro. Alguns quimiocinas participarem na regulação do apetite e regulamento de temperatura do corpo no hipotálamo1 como fator de necrose tumoral-alfa (TNFa), interleucina (IL) -6, IL-1 β, monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) e CCL5 (ligante motivo C-C 5 ). Além disso, a inflamação no hipotálamo leva à resistência à insulina em T2DM2,3.
Entre estes quimiocinas, a alteração dos níveis de expressão de chemokine CCL5 e seu receptor, CCR5, em tecidos adiposo tem sido associada com arteriosclerose e glicose intolerância em T2DM em humanos como em animais. CCL5 também tem funções neuroendócrinas, incluindo a regulação da temperatura de corpo e ingestão de comida, no hipotálamo. Assim, é importante investigar se CCL5 participa da ativação de sinal de insulina dentro do hipotálamo ou os tecidos periféricos.
Sinalização de insulina é fortemente regulamentado dentro das células. A ligação de receptores de insulina para insulina (IR) ativa proteínas de substrato (IRS) do receptor insulin, seguidas de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e proteína quinase B (PKB/AKT) ativação e glicose transporte-4 (GLUT4) membrana translocação4 . Proteínas de IRS são os reguladores chaves nesta via de sinalização: eles têm vários resíduos tirosina e serina, que podem ser fosforilados em resposta a positivo ou negativa insulina sinaliza5. Por exemplo, fosforilação da serina 302 em IRS-1 pode causar a dissociação física do IRS-1 do IR e bloquear a transdução de sinal de insulina, levando à insulina resistência6. A deficiência de atividade de proteínas IRS no hipotálamo tem demonstrada induzir resistência à insulina e intolerância à glicose em ratos7.
Uma maneira comum de estudar a função de um gene específico é a manipulação da expressão de genes alvo, distribuídos ao longo de todo o corpo do organismo. No entanto, isto pode ter várias desvantagens: 1) pode gerar efeitos de regulamentação ou compensatórios de feedback diferentes ao longo do tempo e 2) este método não nos ajuda a ilustrar o papel da proteína alvo em regiões específicas do cérebro. Também, específicas de tecido e célula gene nocaute animais levar um longo tempo para se reproduzir… e são caras. Assim, usamos um curto prazo sistema de bomba osmótica infusão cérebro – uma maneira relativamente rápida e conveniente de interferir com a sinalização da proteína alvo no cérebro usando a droga antagonista para superar os problemas acima mencionados. Estereotáxica injeções costumávamos exigir habilidade cirúrgica intrincada e extensivo investimento em tempo e instrumentação. Neste protocolo, nós fornecemos uma maneira simples e segura para realizar a injeção estereotáxica e um método rápido, menos prejudicial e instantâneo para detectar a concentração de glicose no sangue e investigar o papel de CCL5 no hipotálamo insulina sinalização de regulamento.
O mecanismo da inflamação crônica e quimiocinas relacionadas como CCL5 e seu receptor – CCR5 no desenvolvimento do diabetes tipo 2 permanece obscuro. A inflamação crônica provoca infiltração de macrófagos nos tecidos adiposo e afeta o Regulamento de adipocinas; Entretanto, também atrai as células β e prejudica a secreção de insulina das ilhotas de Langerhans em resposta à glicose no sangue. Hipotálamo no cérebro desempenha um papel importante como um centro de controle, na coordenação de insulina e adipokine sinais dos tecidos periféricos sistêmicos em regular o apetite, o metabolismo da glicose do sangue periférico e a resposta de insulina. Muitos estudos também indicam que a inflamação hipotalâmica leva a defeituosa regulação da homeostase de energia bem como defeituosa ilhotas pancreáticas e função hepática2,3,9,10. CCL5 no cérebro contribui para a regulação de temperatura ingestão e corpo comida ao hipotálamo11,,12; no entanto, a correlação de CCL5 para sinalização de insulina hipotalâmica e sistêmica está clara. Para resolver esta questão, que mostra um fenótipo de resistência de insulina com maiores níveis de insulina e níveis elevados de glicose no sangue8foi gerado um rato de nocaute de corpo inteiro CCL5 (CCL5– / –). No entanto, requer muito tempo para desenvolver o fenótipo T2DM e é difícil de investigar o papel e o mecanismo de CCL5 em sinal de insulina hipotalâmico devido a possíveis efeitos compensatórios a longo prazo. Portanto, uma manipulação direta de CCL5 sinalização nos neurônios do hipotálamo é a melhor abordagem. Há, no entanto, vários tipos de neurônios na região do hipotálamo e é bastante caro e demorado para gerar camundongos nocaute específicos de célula. Utilizando um ICV de infusão pode, assim, poupar tempo e fornecem uma abordagem mais específica para manipular CCL5 função diretamente no cérebro, ignorando possíveis reações inflamatórias periféricas.
Estudos utilizando bombas osmóticos já publicados anteriormente, proporcionando grandes exemplos e demonstrações de técnicas envolvidas na implantação de bombas osmóticos em roedores13. No entanto, enfrentamos alguns desafios ao seguir esses protocolos em nosso estudo. Primeiro, alguns dos equipamentos utilizados no protocolo é bastante caro, incluindo 1) o sistema elétrico para chegar ao local, desenho e inserir a agulha no cérebro de rato, 2) o sistema thermo para manter a temperatura do corpo do mouse e 3) o oxigênio-isoflurano fornecimento de sistema para administrar anestesia para ratos. Em segundo lugar, as técnicas descritas em outros artigos eram difíceis de replicar porque só fomos capazes de utilizar animais dentro de um pequeno intervalo de peso corporal e em determinadas idades para nosso estudo. Estamos conscientes de que os ratos maiores são mais adequados para a cirurgia e implantação. No entanto, em nosso estudo, nós tivemos que usar ratos menores e mais jovens para evitar o excesso de peso e os efeitos do envelhecimento na regulação de glicose insulina e sangue: somente ratos masculinos com corpo de peso 25 ± 2 g e idade cerca de 2 meses de idade foram escolhidos no estudo. Assim, é difícil de realizar a cirurgia e suturar a ferida na cabeça do rato. Em terceiro lugar, a resposta inflamatória tem que ser minimizada após a cirurgia, desde que uma citocina inflamatória é o alvo neste estudo. Ratos e ratazanas podem remover a sutura e feridas abertas facilmente após a cirurgia, o que irá resultar em inflamação e aumentar as reações do chemokine. Portanto, uma estratégia para chegar ao local e desenhar e inserir a agulha no cérebro de rato que evita a infecção secundária é necessária. Portanto, nós modificamos os protocolos descritos anteriormente para fazer esta técnica custo-eficaz, mais fácil e menos prejudicial para os animais, conforme descrito no parágrafo seguinte.
Em primeiro lugar, nós costumávamos uma broca do prego manualmente um furo ao redor da área de destino marcada no crânio, conforme descrito na etapa 2.6. Este método é rentável e permite controlar todo o procedimento, a fim de não danificar o rato meninges e dos vasos sanguíneos. Regulamento de glicose do sangue é prejudicado após acidente vascular cerebral agudo, tais como uma hemorragia no cérebro. Hiperglicemia aguda e diabetes-como síndromes também foram observados após acidente vascular cerebral em ambientes clínicos14,15. Da mesma forma, também encontramos resposta de nível e insulina glicose prejudicada em camundongos com hemorragia e pus no cérebro. Estamos conscientes de que controle melhor da cirurgia baseada no manual é necessária para garantir a consistência dos resultados. Em segundo lugar, aproveitamos um recém-desenvolvido biomaterial médica comumente usado em clínicas, colagem adesiva de tecido (passo 2.8), para selar a pele na cabeça do rato após a cirurgia, portanto, evitando pontos e acelerar a taxa de cura. Isto facilita os procedimentos cirúrgicos executar e reduz a possibilidade de inflamação secundária. Em terceiro lugar, o tempo necessário para executar todo o procedimento cirúrgico é comparativamente mais curto, que aumenta a chance de sobrevivência para os ratos e reduz a dose da droga anestésica, sendo injectada intraperitonealmente. Nós observada uma taxa de sobrevivência de alta (95%) e obteve resultados relativamente precisos seguindo este protocolo modificado.
A limitação dessa técnica é o período de tempo relativamente curto de entrega da droga. Embora uma bomba osmótica pode ser colocada no corpo do mouse como alternativa sem re-abertura do cérebro, nosso estudo apenas incide sobre o efeito do chemokine inflamatória no cérebro para regular a sinalização de insulina sistêmica periférica. Cirurgia adicional em tecidos periféricos possivelmente poderia induzir uma reação inflamatória nos tecidos periféricos, que então aumentaria a expressão de chemokine inflamatória e afetar os resultados. Em segundo lugar, a meia-vida da droga também limita a duração do estudo. Proteínas recombinantes como chemokine geralmente têm uma meia-vida mais curta, que perde sua atividade ao longo do tempo, embora ela também nos permite estudar o efeito de bloqueio CCL5 sinalização no cérebro a curto prazo. Nossos estudos anteriores também descreveram uma abordagem de modificação genética para gerar um rato de nocaute CCL5, que fornece um modelo com a longo prazo efeitos8.
Existem algumas novas técnicas e métodos alternativos para entregar drogas para o cérebro. A nanotecnologia é uma técnica poderosa, que pode ser usada para entregar drogas no sistema nervoso central. No entanto, muitos medicamentos são termossensível e podem ser destruídos quando tentando empacotá-los em nanopartículas16. Além disso, nanopartículas podem passar BBB e ser captação pelas células que são apropriados para siRNA ou drogas mais comuns, mas não é um método ideal para ligação ao ligante-receptor.CCL5 requer ligação ao seu receptor, CCR5, nos neurônios hipotálamo ARC para levar a efeito8, e a entrega de CCL5 antagonista CCL5 Metem neurônios através de nanopartículas pode causar uma perda da habilidade para ligar e bloquear o CCR5 na célula superfície.
O nível de glicose no sangue foi significativamente maior em camundongos administrados com o antagonista-CCL5 MetCCL5, em comparação com os controles (ratos administrados com aCSF) no teste de tolerância a glicose oral. Administração de insulina adicional (teste de tolerância à insulina) também foi capaz de diminuir o sangue glicose nível no MetCCL5 recebendo ratos (Figura 4B), que sugere que a insulina endógena e externa não pode reduzir níveis de glicose no sangue Quando bloqueio hipotalâmico CCL5 sinalização. Os ratos tornou-se resistente à insulino, sem atividade CCL5 no hipotálamo. Serine302 aumento de fosforilação do IRS-1 foi encontrada nos ratos recebendo Met-CCL5 comparado aos ratos controle recebendo aCSF (Figura 5A-B). Fosforilação da serina 302 do IRS-1 tem sido mostrada para induzir uma dissociação física do IRS-1 do receptor de insulina, que é das principais causas de resistência de insulin6; a insulina é possível activar sinais a jusante, tais como a via PI3K-Akt. Um estudo de estimulação de insulina ex vivo confirmou a insulina a jusante molécula de sinalização Akt (p-AktS473) não foi ativada por insulina no tecido hipotalâmico rato infundido com Met-CCL5 e, em vez disso, a fosforilação da serina 302 aumentou. No total, dados fisiológicos (OGTT e ITT) e estudo molecular demonstram que hipotalâmico CCL5 sinalização Medeia o Regulamento de sinal de insulina hipotalâmico, que contribui para o metabolismo de insulina sistemática resistência e glicose.
A função e o mecanismo de CCL5 e CCR5 em diabetes associada a obesidade ainda não está claro. Kitade et al relataram que a deficiência CCR5 protegidos ratos da inflamação induzida pela obesidade, recrutamento de macrófagos e de resistência de insulin17. No entanto, outros estudos por Kennedy et al encontraram resultados opostos, indicando que CCR5 deficiência prejudica a tolerância à glicose sistêmica, bem como dos adipócitos e muscular insulina sinalização18. Ambos os estudos aplicados a uma dieta de alto teor de gordura para induzir a obesidade, o que leva a inflamação crônica de corpo inteiro e resposta compensatória. Estes estudos não forneceram mecanismos limpos e claros de CCL5 e CCR5 no Regulamento de sinalização de insulina. Por outro lado, a técnica de bomba osmótica permite uma infusão específicas do cérebro e evita a resposta compensatória com tempo limitado para entrega.
Em conclusão, embora a bomba osmótica com o sistema de infusão de cérebro parece ser uma técnica “antiga”, ele fornece um método mais barato, mais fácil e menos prejudicial de entrega de drogas e ajuda a investigar a função de sinalização em ligante-receptor o cérebro.
The authors have nothing to disclose.
Estamos gratos a com suporte do Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan – sobretaxa MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), saúde e bem-estar dos produtos do tabaco – MOHW106-TDU-B-212-144001-S-Y C.
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
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Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |