Ce protocole étudie le rôle de ligand de chemokine (C-C motif) 5 (CCL5) dans l’hypothalamus en livrant un antagoniste, MetCCL5, dans le cerveau de souris à l’aide d’un système de perfusion de cerveau pompe micro-osmotique. Cette inhibition transitoire de l’activité CCL5 interrompu insuline hypothalamique, signalisation, entraînant une intolérance au glucose et sensibilité à l’insuline systémiques périphériques.
L’insuline régule le métabolisme systématique dans l’hypothalamus et la réponse insulinique périphériques. Une réaction inflammatoire dans les tissus adipeux périphériques contribue au développement de type 2 mellitus de diabète (T2DM) et régulation de l’appétit dans l’hypothalamus. Type de récepteur de chimiokine Chemokine CCL5 et C-C 5 niveaux (CCR5) ont été suggérés à la médiation de l’artériosclérose et le glucose intolérance au diabète de type 2 (T2DM). En outre, CCL5 joue un rôle neuroendocrine dans l’hypothalamus en réglant l’alimentation consommation et la température corporelle, ainsi, nous incitant à enquêter sur son rôle dans la signalisation de l’insuline hypothalamique et la régulation du métabolisme périphérique de glucose.
Le système de perfusion de cerveau pompe micro-osmotique est un moyen rapide et précis de manipuler la fonction CCL5 et étudier ses effets dans le cerveau. Il fournit également une approche alternative pratique pour générer un animal transgénique knock-out. Dans ce système, CCL5 de signalisation a été bloquée par une perfusion intracérébroventriculaire (ICV) de son antagoniste, CCL5 Met, à l’aide d’une pompe micro-osmotique. La sensibilité d’insuline et le métabolisme périphérique de glucose a été détectée par le Test Oral de tolérance Glucose (HGPO) et le Test de tolérance de l’insuline (ITT). L’insuline, l’activité de signalisation a été ensuite analysé par protéine tache d’échantillons de tissus provenant d’animaux.
Après 7 à 14 jours de MetCCL5 perfusion, le métabolisme du glucose et d’insuline réactivité a été altérée chez les souris, comme on le voit dans les résultats de l’HPO et ITT. La phosphorylation de serine302 IRS-1 a été augmentée et l’activité de l’Akt a été réduite dans les neurones hypothalamiques souris après inhibition de CCL5. Au total, nos résultats suggèrent que le blocage de CCL5 dans le cerveau de souris augmente la phosphorylation de l’IRS-1 S302 et interrompt la signalisation de l’insuline hypothalamique, conduisant à une diminution en fonction de l’insuline dans les tissus périphériques ainsi que l’altération du glucose métabolisme.
L’insuline affecte une grande variété de tissus, y compris le cerveau. L’insuline passe à travers la barrière hémato – encéphalique, pénètre dans le système nerveux central (CNS) et se lie avec le récepteur de l’insuline (IR) dans l’hypothalamus pour réguler la prise alimentaire, l’activité sympathique et la réponse insulinique périphériques. L’inflammation chronique dans les tissus adipeux périphériques a été proposée de contribuer au type 2 mellitus de diabète (T2DM), mais comment ces réactions inflammatoires affectent l’insuline des signaux dans l’hypothalamus à la médiation d’intolérance de glucose et de la réponse systémique de l’insuline reste floue. Certaines chimiokines participent à la régulation de l’appétit et régulation de température du corps dans l’ hypothalamus1 comme facteur de nécrose tumorale-alpha (TNFα), interleukine (IL) -6, IL-1β, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) et CCL5 (ligand de C-C motif 5 ). En outre, l’inflammation dans l’hypothalamus conduit à la résistance à l’insuline dans le T2DM2,3.
Parmi ces chimiokines, la modification des niveaux d’expression de chimiokine CCL5 et son récepteur, CCR5, dans les tissus adipeux a été associée à l’intolérance, artériosclérose et le glucose, dans le T2DM dans les humains, mais aussi des animaux. CCL5 a également des fonctions neuro-endocrines, notamment la régulation de la température de corps et de l’apport alimentaire, dans l’hypothalamus. Il est donc important d’examiner si CCL5 participe à l’activation de signal de l’insuline au sein de l’hypothalamus ou les tissus périphériques.
Signalisation de l’insuline est étroitement contrôlée dans les cellules. La liaison des récepteurs de l’insuline à l’insuline (IR) active les protéines substrat (IRS) récepteur d’insuline, suivies de phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) et la protéine kinase B (PKB/AKT) activation et glucose transporteur-4 (GLUT4) membrane translocation4 . IRS protéines sont les principaux régulateurs dans cette voie de signalisation : ils ont plusieurs résidus de tyrosine et de la sérine, qui peuvent être phosphorylées en réponse aux résultats positifs ou négatif insuline signaux5. Par exemple, phosphorylation de sérine 302 sur IRS-1 peut conduire à la dissociation physique d’IRS-1 de IR et bloquer la transduction de signal de l’insuline, menant à l’insuline résistance6. L’altération de l’activité des protéines IRS dans l’hypothalamus a été démontrée pour induire la résistance à l’insuline et l’intolérance au glucose dans souris7.
Une façon courante d’étudier la fonction d’un gène spécifique est la manipulation de l’expression des gènes cibles répartis dans l’ensemble de l’organisme. Toutefois, cela peut avoir plusieurs inconvénients : 1) on peut générer différents effets réglementaires ou compensatoire au fil du temps et 2) cette méthode nous aide-t-il pas à illustrer le rôle de la protéine cible dans les régions spécifiques du cerveau. En outre, animaux de knock-out pour le gène spécifiques aux tissus et cellules prendre beaucoup de temps pour se reproduire et est coûteux. Ainsi, nous utilisons un système de pompe osmotique de perfusion cérébrale à court terme – une façon relativement rapide et pratique d’interférer avec la signalisation de la protéine cible dans le cerveau en utilisant le médicament antagoniste pour surmonter les problèmes susmentionnés. Stéréotaxiques injections utilisées d’exiger des compétences chirurgicales complexes et vastes investissements dans le temps et l’instrumentation. Dans ce protocole, nous fournissons un moyen simple et sûr d’effectuer l’injection stéréotaxique et une méthode moins nocif, instantanée et rapide pour détecter la concentration de glucose dans le sang et enquêter sur le rôle de CCL5 en insuline hypothalamique règlement de signalisation.
Le mécanisme de l’inflammation chronique et des chimiokines connexes, comme la CCL5 et son récepteur – CCR5 dans le développement du diabète de type 2 ne sait pas. L’inflammation chronique provoque l’infiltration de macrophages dans les tissus adipeux et influe sur la réglementation des adipokines ; dans l’intervalle, elle aussi attire les cellules β et altère la sécrétion d’insuline des îlots de Langerhans en réponse au glucose dans le sang. Hypothalamus dans le cerveau joue un rôle important comme un centre de contrôle dans la coordination de l’insuline et adipokine signaux provenant des tissus périphériques systémiques dans la régulation de l’appétit, métabolisme du glucose du sang périphérique et la réponse insulinique. De nombreuses études indiquent également que l’inflammation hypothalamique mène à défectueuse régulation de l’homéostasie énergétique ainsi que des îlots pancréatiques défectueux et la fonction hépatique2,3,9,10. CCL5 dans le cerveau contribue à la régulation de température alimentaire l’apport et le corps dans l’hypothalamus11,,12; Cependant, la corrélation entre les CCL5 pour la signalisation de l’insuline hypothalamique et systémique n’est pas claire. Une souris de coup de grâce de tout le corps CCL5 (CCL5– / –) a été générée pour répondre à cette question, qui présente un phénotype de résistance d’insuline avec des niveaux plus élevés d’insuline et de glucose sanguin élevé dans le sang,8. Toutefois, elle nécessite beaucoup de temps pour développer le phénotype T2DM et il est difficile d’examiner le rôle et le mécanisme de CCL5 en insuline hypothalamique signal en raison de possibles effets compensatoires à long terme. Par conséquent, une manipulation directe des CCL5 la signalisation dans les neurones hypothalamiques est la meilleure approche. Il y a, cependant, plusieurs types de neurones dans la région hypothalamique et c’est assez long et coûteux de générer chez des souris knockout spécifique cellulaire. Système de perfusion, utilisant un ICV peut ainsi gagner du temps et offrent une approche plus spécifique pour manipuler la fonction CCL5 directement dans le cerveau, sans passer par des réactions inflammatoires périphériques possibles.
Des études utilisant les pompes osmotiques ont déjà été publiés auparavant, fournissant de bons exemples et des démonstrations de techniques impliqués dans l’implantation des pompes osmotiques dans rongeurs13. Cependant, nous fait face à quelques difficultés en suivant ces protocoles dans notre étude. Tout d’abord, l’équipement utilisé dans le protocole est assez cher, y compris 1) le système électrique pour atteindre l’emplacement, de dessin et d’insérer l’aiguille dans le cerveau de souris, 2) le système thermo pour maintenir la température corporelle de souris et 3) l’oxygène-isoflurane alimentation système à administrer l’anesthésie de souris. En second lieu, les techniques décrites dans d’autres articles ont été difficiles à reproduire parce que nous n’avons pu utiliser des animaux à l’intérieur une petite gamme de poids et à un certain âge pour notre étude. Nous sommes conscients que les souris plus gros sont plus adaptés pour la chirurgie et l’implantation. Cependant, dans notre étude, nous avons dû utiliser la souris plus petites et plus jeunes pour éviter la surcharge pondérale et les effets du vieillissement sur la régulation glycémique insuline et sang : seulement des souris mâles avec corps poids 25 ± 2 g et l’âge environ de 2 mois ont été choisis dans l’étude. Ainsi, il est difficile de pratiquer une intervention chirurgicale et suture de la plaie sur la tête de souris. En troisième lieu, la réponse inflammatoire doit être réduite au minimum après la chirurgie une cytokine inflammatoire étant la cible dans cette étude. Souris et les rats peuvent retirer la suture et plaies ouvertes facilement après la chirurgie, qui va entraîner une inflammation et augmenter les réactions de chimiokine. Par conséquent, une stratégie pour atteindre l’emplacement et de dessiner et d’introduire l’aiguille dans le cerveau de souris qui permet d’éviter une infection secondaire est nécessaire. Par conséquent, nous avons modifié les protocoles décrites précédemment pour faire cette technique rentable, plus facile et moins dangereux pour les animaux, tel que décrit dans le paragraphe suivant.
Tout d’abord, nous avons utilisé un foret d’ongle pour faire manuellement un trou autour de la zone cible marquée sur le crâne, comme indiqué au point 2.6. Cette méthode est efficace et permet de surveiller l’ensemble de la procédure afin d’éviter d’endommager les méninges de la souris et les vaisseaux sanguins. Régulation du glucose sanguin est altérée après accident vasculaire cérébral aigu, comme une hémorragie dans le cerveau. L’hyperglycémie aiguë et des syndromes de type diabète ont également observés après un AVC dans les milieux cliniques14,15. De même, nous avons également trouvé réponse insuline et niveau d’intolérance au glucose chez les souris présentant une hémorragie et pus dans le cerveau. Nous sommes conscients que mieux contrôler axée sur le manuel de la chirurgie est nécessaire pour assurer la cohérence des résultats. Deuxièmement, nous avons profité d’un biomatériau médical nouvellement mis au point, couramment utilisé dans les cliniques, colle tissu (étape 2.8), pour sceller la peau sur la tête de souris suivant la chirurgie, donc, en évitant les points de suture et à accélérer le taux de guérison. Cela rend les interventions chirurgicales plus facile à réaliser et réduit le risque d’inflammation secondaire. Troisièmement, le temps requis pour exécuter l’ensemble de la procédure chirurgicale est relativement court, qui augmente les chances de survie pour les souris et abaisse la posologie du médicament anesthésique est injecté par voie intrapéritonéale. Nous avons observé un taux de survie élevé (95 %) et a obtenu des résultats relativement précis en suivant ce protocole modifié.
La limitation de cette technique est le laps de temps relativement court de délivrance de médicaments. Même si une pompe osmotique peut être placée dans le corps de la souris vous pouvez également sans réouverture du cerveau, notre étude seulement porte sur les effets de chimiokines inflammatoires sur le cerveau pour réguler l’insuline systémique périphérique de signalisation. Une chirurgie additionnelle dans les tissus périphériques puisse éventuellement induire une réaction inflammatoire dans les tissus périphériques, qui serait ensuite augmenter l’expression de chimiokines inflammatoires et influe sur les résultats. Deuxièmement, la demi-vie du médicament limite également la durée de l’étude. Protéines recombinantes comme chemokine ont généralement une demi-vie plus courte, qui perd de son efficacité au fil du temps, bien qu’il nous permet également d’étudier l’effet de blocage CCL5 de signalisation dans le cerveau à court terme. Nos études précédentes ont également décrit une approche de modifications génétiques pour générer une souris knockout CCL5, qui fournit un modèle d’effets à long terme8.
Il y a quelques nouvelles techniques et des méthodes alternatives pour livrer des médicaments dans le cerveau. La nanotechnologie est une technique puissante, qui peut être utilisée pour livrer la drogue dans le système nerveux central. Cependant, de nombreux médicaments sont thermosensibles et peuvent être détruits en essayant de les emballer dans des nanoparticules16. En outre, des nanoparticules peuvent passer par BBB et être absorbée par les cellules qui conviennent aux siARN ou médicaments plus fréquemment, mais il n’est pas une méthode idéale pour la liaison ligand-récepteur.CCL5 requiert la liaison à son récepteur, CCR5, dans les neurones d’ARC hypothalamus pour prendre effet,8, et la livraison d’antagoniste CCL5 MetCCL5 en neurones grâce à des nanoparticules pourrait entraîner une perte de la capacité de lier et de bloquer le CCR5 sur la cellule surface.
Le taux de glycémie était significativement plus élevée chez les souris ayant reçu avec l’antagoniste CCL5 MetCCL5 contre les contrôles (souris administrés avec aCSF) dans l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale. L’administration d’insuline supplémentaire (test de tolérance à l’insuline) n’a pu réduire la glycémie en MetCCL5 recevoir souris (Figure 4 b), ce qui suggère que l’insuline endogène et à l’externe ne peut pas réduire la glycémie lors du blocage de CCL5 de signalisation hypothalamique. Souris sont devenus résistants à l’insuline sans activité CCL5 dans l’hypothalamus. Serine302 accrue la phosphorylation de l’IRS-1 a été trouvée chez les souris recevant Met-CCL5 par rapport aux souris témoins recevant le FSCA (Figure 5 a-B). Phosphorylation de sérine 302 d’IRS-1 a été montrée pour induire une dissociation physique de l’IRS-1 depuis le récepteur de l’insuline, qui est une cause importante d’insuline résistance6; l’insuline ne peut pas activer les signaux en aval comme la voie PI3K-Akt. Une étude de stimulation ex vivo l’insuline a confirmé l’insuline molécule de signalisation en aval Akt (p-AktS473) n’était pas activé par l’insuline dans le tissu hypothalamique souris imprégné de Met-CCL5 et, au lieu de cela, la phosphorylation de la sérine 302 a augmenté. Au total, les données physiologiques (HGPO et ITT) et étude moléculaire montrent que CCL5 de signalisation hypothalamique intervient dans le règlement de signal insuline hypothalamique, qui contribue au métabolisme de glucose et de résistance systématique de l’insuline.
Le rôle et le mécanisme de CCL5 et CCR5 dans associées à l’obésité diabète reste floue. Kitade et coll. ont signalé que CCR5 carence protégeait les souris de l’inflammation induite par l’obésité, le recrutement de macrophages et insuline résistance17. Toutefois, autres études par Kennedy et coll. ont trouvé des résultats opposés indiquant que CCR5 lacune entrave au glucose systémique ainsi que musculaires et les adipocytes insuline signalisation18. Les deux études appliquent à une alimentation riche en graisses pour provoquer l’obésité, ce qui conduit à une inflammation chronique tout le corps et réaction compensatoire. Ces études ne fournissent pas de mécanismes propres et claires de CCL5 et CCR5 dans Règlement de signalisation d’insuline. En revanche, la technique de pompe osmotique permet une cervelle spécifique et permet d’éviter une réaction compensatoire avec sa livraison limitée dans le temps.
En conclusion, même si la pompe osmotique avec le système de perfusion de cerveau semble être une technique « démodée », il fournit une méthode moins cher, plus facile et moins dangereux de medicaments et contribue à étudier la fonction du ligand-récepteur de signalisation dans le cerveau.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions la prise en charge du ministère de la Science et technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), santé et bien-être en supplément des produits du tabac – MOHW106-SAB-B-212-144001 à S-Y C.
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
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Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |