Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama
Summary
Streptococcus mutans çoğunlukla gen kesintiye üretimi için facile, hızlı ve nispeten ucuz bir yöntem tarif suşları; Bu teknik gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte olabilir.
Abstract
Tipik yöntemleri için belirli bir gen işlevini aydınlatma vahşi tipi zorlanma ve faiz gen getirilmiş bir yük karşılaştırmalı fenotipik analizlerini içerir. Uygun antibiyotik direnci marker gen içeren bir gen-bozulma DNA yapısı gen kesintiye suşları bakterilerde nesil için yararlıdır. Ancak, Gen Klonlama adımlar gerektirir, geleneksel inşaat yöntemleri karmaşık ve zaman alıcı protokolleri içerir. Burada, Streptococcus mutans çoğunlukla hedeflenen gene bozulma için nispeten facile, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem 2-adım füzyon Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) bozulma yapý ve elektroporasyon genetik dönüşüm oluşturmak için kullanır. Bu yöntem does değil istemek dışında PCR, enzimatik reaksiyon ve ayrıca bozulma yapı tasarım açısından daha büyük esneklik sağlar. Elektroporasyon istihdam yetkili hücreleri hazırlanması kolaylaştırır ve dönüşüm verimliliği artırır. Mevcut yöntem gen kesintiye suşların çeşitli tür üretimi için adapte olabilir.
Introduction
Gene işlev analiz genellikle bir vahşi tipi yük ve ilgi belirli bir gen getirilmiş bir yük arasında fenotipik bir karşılaştırma içerir. Bu gen-bozulma teknik gen işlevi analizleri takson, memeliler için bakterilerden geniş bir alanda kullanılmıştır. Gen alt üst baskı üretimi için gerekli bir gen-bozulma yapıdır; Bu deoksiribonükleik asit (DNA) yapı akış yukarı ve aşağı akım hedef gen bölgelerinde kanat erimiş antibiyotik direnci marker gen oluşur ve homolog rekombinasyon ile genom içine dahil edilmiştir. Gen kesintiye zorlanma antibiyotik içeren seçmeli medya kullanarak izole olabilir. Gen kesintiye zorlanma yapımı için kullanılan geleneksel yöntem Polimeraz zincir tepkimesi (PCR), gen ligasyonu içine uygun bir plazmid, hazım ile sınırlama tarafından hedef gen amplifikasyon gibi karmaşık adımlar gerektirir enzimler ve antibiyotik direnç marker gen eklemek için religation. Her adım başarısını bağlı olarak birkaç hafta için birkaç gün alarak zaman alıcı bir süreçtir. Buna ek olarak, tasarım kesintileri yapıları, hedef gen restriksiyon enzimi sitelerinde bağlıdır. Bu sorunları gidermek için DNA PCR tabanlı yapıştırma yöntemleri1,2 tasarım Dictyostelium discoideum3 ve Synechocystis sp. PCC68034 mutant gen bozulduğu için bildirilmiştir. Bu da çalışmanın, kesintiye uğraması yapımı için (2-adım füzyon PCR belirlenmiş) değiştirilmiş bir PCR tabanlı yöntemi kullanan bir nispeten hızlı, facile ve ucuz şekilde bir gen kesintiye streptokok yük oluşturmak için bir yöntem geliştirildi yapý ve elektroporasyon genetik dönüşüm.
PCR genomik DNA, antibiyotik direnci marker gen PCR şablon olarak ve dört çift uygun şekilde gerektirir 2-adım füzyon Oligonükleotid astar tasarlanmış. İlk adım (1st PCR), hedef gen, hedef 1-kb aşağı akım kanat bölge 1-kb ters yönde kanat bölge gen ve antibiyotik direnç marker gen PCR ile güçlendirilmiş. 5′ bölgeleri ters astar ve amplifikasyon upstream ve downstream için ileri astar bölgeler, sırasıyla, kanat 15 üsleri marker gen sonuna kadar tamamlayıcı içerir. İleriye ve geriye doğru astar marker gen amplifikasyon için 5′ bölgeleri aynı şekilde 15 üsleri hedef gen ters yönde kanat bölgesinin alt sonuna ve akış aşağı kanat hedef gen bölgesinin üst sonu için tamamlayıcı dahil, anılan sıraya göre. Bu nedenle, üç güçlendirilmiş parçaları üst üste gelen 30-baz çifti bölgesini fusion sitesinde içerir. İkinci adımda (2nd PCR), PCR 1st PCR Şablonlar olarak tarafından güçlendirilmiş üç parçaları kullanarak iç içe geçmiş PCR astar ile gerçekleştirilir. Şablonlar tamamlayıcı bölgelerinde Ayrıca 2nd PCR birbirine bağlıdır. Son olarak, yapı homolog rekombinasyon için vahşi tipi zorlanma için elektroporasyon tarafından tanıtıldı. Başarılı gene bozulma belirli primerler kullanılarak PCR tarafından doğrulanmadı. Yüksek sadakat DNA polimeraz kullanarak bozulma yapısı güçlendirilmiş, DNA ligasyonu veya DNA sindirim, gibi ek enzimatik reaksiyonları yapı oluşturmak gerekli değildir. Buna ek olarak, genom bir silinmiş veya korunmuş bölge esnek astar tasarım göre seçmiş olabilirsiniz.
Mevcut çalışma, Streptococcus mutans çoğunluklaglucosyltransferase kodlar, gtfC gen tüm kodlayıcı bölge silme hızlı, kolay gen bozulma yönteminde bir streptokok türleri göstermek için gerçekleştirildi. Ayrıca, bir gtfB-kesintiye zorlanma aynı şekilde oluşturulur. GtfC ve gtfB tarafından kodlanmış glucosyltransferases katkıda bulunmak için cariogenic diş biyofilm geliştirme5,6. Vahşi türü biyofilm oluşturmayan yetenekler (S. mutans çoğunlukla WT), gtfCsoy-kesintiye zorlanma (S. mutans çoğunlukla ΔgtfC) ve gtfB-kesintiye zorlanma (S. mutans çoğunlukla ΔgtfB) değerlendirildi fenotipik karşılaştırmalı analizler için. Bu iletişim kuralı gene bozulma için ek bir tür için bir iki adım yöntemi uygulanması genişletir ve çalışmalar gen fonksiyonunu kullanabilirsiniz takson daha geniş bir yelpazesi için değiştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokolünde astar 1st PCR için yaklaşık 1 kb upstream ve downstream genom hedef bölgede bölgelerinde kanat yükseltmek için tasarlanmış olmalıdır. Homolog rekombinasyon verimliliğini artırmak gerekli uzun kanat böyle dizileridir.
Astar dizisi (up-geri, aşağı-ileri, spcr-ileri ve spcr-ters) Bu protokol için otomatik olarak bozulma yapı birleşme ücreti göre belirlenmiştir. Her astar 15 üsleri tamamlayıcı 2n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser bilim promosyon [Grant sayıları 16 K 15860-m. ve 15 K 15777 N.H. için] Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
