In-vitro- Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomen
Summary
Frühen Endosom Funktionen hängen F-Aktin-Polymerisation. Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu biochemischen und genetischen Manipulationen.
Abstract
Viele frühen Endosom Funktionen, insbesondere Ladung Eiweiß Sortier- und Membran Verformung, kurz F-Aktin-Filamente kernhaltige auf Endosomal Membrane Flecken hängen. Wir haben festgestellt, einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt, wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu genetischen und biochemischen Manipulationen. Endosomal Fraktionen werden von float in Saccharose Steigungen aus Zellen, die mit dem Ausdruck der frühen Endosomal Protein GFP-RAB5 vorbereitet. Cytosolischen Brüche bereiten wir aus separaten Chargen von Zellen. Endosomal und cytosolischen Brüche können gespeichert werden in flüssigem Stickstoff eingefroren bei Bedarf. In dem Assay Endosomal und cytosolischen Brüche werden gemischt und die Mischung wird bei 37 ° C unter geeigneten Bedingungen (z. B. Ionenstärke, Verringerung der Umwelt) inkubiert. Zum gewünschten Zeitpunkt die Reaktionsmischung ist fest und die F-Aktin erschließt sich mit Phalloidin. Aktin Nukleation und Polymerisation werden dann durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Hier berichten wir, dass dieser Test verwendet werden, um die Rolle der Faktoren zu untersuchen, die entweder in Aktin Nukleation auf der Membran oder im nachfolgenden Dehnung, Verzweigungen oder Vernetzung von F-Aktin-Filamente beteiligt sind.
Introduction
In höheren Eukaryoten Zellen sind Proteine und Lipide in frühen Endosomen verinnerlicht wo sortieren auftritt. Einige Proteine und Lipide, die dazu bestimmt sind, bespielt werden, werden in röhrenförmigen Regionen von den frühen Endosomen aufgenommen und dann transportiert die Plasmamembran oder die Trans-Golgi-Netzwerk (TGN)1,2. Im Gegensatz dazu sind andere Proteine und Lipide selektiv in Regionen von den frühen Endosomen verpackt, die ein multivesicular Erscheinungsbild aufweisen. Diese Regionen zu erweitern und nach Loslösung von frühen Endosomal Membranen, schließlich Reifen in freien Endosomal Träger Vesikel oder multivesicular Einrichtungen (ECV/MVBs), die verantwortlich sind für die Güterbeförderung in Richtung späten Endosomen1, 2.
Aktin spielt eine entscheidende Rolle in dem Umbau Membranverfahren Endosomal Sortierkapazität und Endosom Biogenese zugeordnet. Protein sortieren auf den recycling Bahnen um die Plasmamembran oder die TGN richtet sich nach der komplexen Retromer und die damit verbundenen Proteine. Diese Sortierung Maschinen scheint die Bildung von recycling Tubuli über Wechselwirkungen von komplexen, Retromer mit der Wespe und Narbe homolog (WASH) komplexen und verzweigten Aktin3,4,5 gekoppelt werden . Im Gegensatz dazu Moleküle bestimmt für Abbau, besonders Signalisierung Rezeptoren aktiviert, die Endosomal Sortierung komplexe erforderlich für Transport (ESCRT)2,6in Intraluminal Vesikel (ILVs) sortiert sind, 7. Während die mögliche Rolle von Actin in der ESCRT-abhängige Sortiervorgang nicht bekannt ist, spielt F-Aktin eine wichtige Rolle in der Biogenese der ECV/MVBs und Transport über frühen Endosomen. Vor allem fanden wir, dass annexin A2 bindet Cholesterin angereicherte Regionen der frühen Endosom und zusammen mit spire1, nucleates F-Aktin-Polymerisation. Die Bildung der verzweigten Aktin-Netzwerks auf Endosomen beobachtet erfordert die verzweigte Aktivität des Proteins Aktin-bezogene (ARP) 2/3 Komplex, sowie der ERM-Protein-Moesin und die Aktin-bindende Protein Cortactin8,9.
Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern wiederherstellt. Dieser Test hat früher zu untersuchen, die Rolle von annexin A2 in F-Aktin Nukleation und Moesin und Cortactin bei der Bildung der Endosomal Aktin Netze8,9. Mit diesem Protokoll in Vitro werden die komplexen Abfolge von Reaktionen auf Endosomen während Aktin-Polymerisation der biochemischen und molekularen Analyse der sequentielle Schritte des Prozesses, einschließlich Aktin Nukleation, lineare zugänglicher Polymerisation, Verzweigung und Vernetzung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aktin spielt eine entscheidende Rolle im Endosom Membran Dynamik4,14. Wir berichteten bereits, dass Aktin Nukleation und Polymerisation auf frühen Endosomen auftreten bilden kleine F-Aktin Patches oder Netzwerke. Diese F-Aktin-Netzwerke sind absolut erforderlich für Membrantransport über frühen Endosomen den Abbau Weg. Eingriffe bei jedem Schritt dieses Prozesses Keimbildung und Polymerisation verhindert Endosom Reifung und somit nachgelagerten Transport zur …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Von der Swiss National Science Foundation unterstützt wurde; Das Schweizer Sinergia-Programm; die polnisch-schweizerischen Forschungsprogramm (PSPB-094/2010); die NFS in der chemischen Biologie; und LipidX von der Schweizer SystemsX.ch Initiative, durch den Schweizerischen Nationalfonds (, J. G.) ausgewertet. O. M. wurde durch eine EMBO langfristige Fellowship (ALTF-516-2012) unterstützt.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
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