In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes
Summary
Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.
Abstract
Molte funzioni di endosoma precoce, particolarmente carico proteico ordinamento e membrana deformazione, dipendono dalla patch di brevi filamenti di F-actina nucleate sulla membrana endosomal. Abbiamo stabilito un dosaggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di genetica e biochimica manipolazioni. Endosomal frazioni vengono preparate dal galleggiamento in pendenze del saccarosio dalle cellule che esprimono la precoce endosomal proteina GFP-RAB5. Citosoliche frazioni sono preparate da batch distinti delle cellule. Endosomal sia citosoliche frazioni possono essere congelate in azoto liquido, se necessario. Nell’analisi, la endosomal e frazioni citosoliche sono mescolate, e la miscela viene incubata a 37 ° C in condizioni appropriate (ad esempio, forza ionica, riducendo l’ambiente). Al momento desiderato, la miscela di reazione è stato risolto, e la F-actina si rivela con falloidina. Polimerizzazione e nucleazione di actina vengono poi analizzati da microscopia di fluorescenza. Qui, segnaliamo che questa analisi può essere usata per studiare il ruolo di fattori che sono coinvolti sia nella nucleazione di actina sulla membrana, o nel successivo allungamento, ramificazione o reticolazione dei filamenti di F-actina.
Introduction
Nelle cellule eucariotiche superiori, proteine e lipidi sono interiorizzati in early endosomes dove si verifica l’ordinamento. Alcune proteine e lipidi, che sono destinati ad essere riutilizzati, sono incorporati in tubolare regioni della early endosomes e poi trasportati alla membrana plasmatica o trans-Golgi network (TGN)1,2. Al contrario, altre proteine e lipidi in modo selettivo sono confezionati in regioni della early endosomes che presentano un aspetto multivesicular. Espandere queste regioni e, al momento di distacco dai primi endosomal membrane, finalmente maturo in vescicole di vettore libero endosomal o MVB (ECV/MVB), che sono responsabili di trasporto di merci verso gli endosomi ritardato1, 2.
Actina svolge un ruolo cruciale nel processo di rimodellamento della membrana associato endosomal ordinamento capacità e biogenesi endosoma. Proteina lungo le vie di riciclaggio alla membrana plasmatica o a livello di TGN dipende il retromer complessi e proteine associate. Questo macchinario ordinamento sembra essere accoppiato alla formazione di riciclaggio tubuli tramite interazioni della retromer complessa, con WASP e cicatrice omologo (WASH) complesse e ramificate actina3,4,5 . Al contrario, molecole destinati al degrado, particolarmente attiva segnalazione recettori, sono filtrate in vescicole intraluminal (ILVs) endosomal ordinamento complessi richiesti per trasporto (ESCRT)2,6, 7. Mentre non è noto il ruolo possibile di actina processo di cernita ESCRT-dipendente, F-actina svolge un ruolo importante nella biogenesi di ECV/MVB e nei trasporti oltre early endosomes. In particolare, abbiamo trovato che Annessina A2 Lega regioni colesterolo-arricchita della endosoma precoce e insieme spire1, costituisce la polimerizzazione di F-actina. La formazione della rete ramificata actina osservata su endosomi richiede l’attività di ramificazione della proteina actina-correlate (ARP) 2/3 complesso, così come l’ERM proteina moesina e i leganti l’actina proteina cortactin8,9.
Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette. Questo test è stato utilizzato in precedenza per studiare il ruolo di Annessina A2 nella nucleazione di F-actina e moesin e cortactin nella formazione di endosomal actina reti8,9. Con questo protocollo in vitro , la complessa serie di reazioni che si verificano in endosomi durante la polimerizzazione dell’actina diventano suscettibile di analisi biochimica e molecolare dei passaggi sequenziali del processo, compresa la nucleazione di actina, lineare polimerizzazione, rami e reticolazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actina svolge un ruolo cruciale nell’endosoma membrana dinamica4,14. Precedentemente abbiamo segnalato che la polimerizzazione e actina nucleazione verificarsi su early endosomes, formando piccole patch di F-actina o reti. Queste reti di F-actina sono assolutamente necessari per il trasporto di membrana oltre early endosomes lungo la via di degradazione. Interferire in ogni fase di questo processo di nucleazione e polimerizzazione previene endosoma maturazione e …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supporto è stato ricevuto da Swiss National Science Foundation; il programma svizzero Sinergia; il polacco-Swiss ricerca programma (PSPB-094/2010); il PRN in biologia chimica; e LipidX dall’iniziativa Svizzera SystemsX.ch, valutati da Swiss National Science Foundation (di J. G.). O. M. è stato sostenuto da una borsa di studio a lungo termine dell’EMBO (ALTF-516-2012).
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
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