ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

最近の証拠は、mRNA合成後に生じる多くの調節機構の役割の理解を変化させている。実際、翻訳、転写後およびタンパク質分解プロセスは、タンパク質の存在量および機能を調節することができる。転写産物レベルがタンパク質存在量の主な決定因子であると仮定して、mRNA濃度が対応するタンパク質のプロキシであると言うドグマは部分的に改訂されている。細胞^1,2内のタンパク質を調節するために起こる。

さらに、タンパク質は最終的に細胞の機能を決定し、したがって自己分泌、傍分泌および内分泌因子に応答して動的変化を起こすことができるその表現型を指示する。血液媒介メディエーター;温度;薬物治療;病気が発症する。このように、タンパク質レベルに焦点を当てた発現解析は、プロテオームの特徴を明らかにするとともに、疾患病因の一部として起こる重大な変化を解明するのに有用である³ 。

したがって、既存の技術的課題にもかかわらず、プロテオミクスが健康状態や病状を明らかにする機会が大いにあります。プロテオミクスが貢献できる研究の特に有望な分野には、以下のものが含まれる：任意のレベル（ すなわち、細胞全体または組織、細胞内コンパートメントおよび生物学的液体）におけるタンパク質発現の変化の同定;疾患の診断および予後に有用な新規なバイオマーカーの同定、検証および検証;薬効と毒性の評価だけでなく、治療目的でも使用できる新しいタンパク質標的の同定⁴ 。

複雑さを捉えるプロテオームは技術的な課題である。現在のプロテオミクスツールは、変化したタンパク質レベルの同定、定量化、および検証のための大規模で高スループットの分析を行う機会を提供する。さらに、最も豊富なタンパク質によって引き起こされる干渉を回避することを目的とする分画および濃縮技術の導入は、最も豊富でないタンパク質を含むことによってタンパク質同定を改善した。最後に、プロテオミクスは、タンパク質機能の重要なモジュレーターとして徐々に出現する翻訳後修飾の分析によって補完されてきた。

しかし、分析中の生物標本における試料調製およびタンパク質回収は、プロテオミクスのワークフローにおける制限的なステップのままであり、潜在的な落とし穴の可能性を高めます⁵ 。実際、最適化されなければならない分子生物学技術の大部分において、最初のステップは、組織ホモジナイズイオンおよび細胞溶解、特に増幅方法が存在しない低濃度のタンパク質の分析中に起こる。さらに、タンパク質の化学的性質は、それら自身の回復に影響を及ぼす可能性がある。例えば、高度に疎水性のタンパク質の分析は、等電点電気泳動の間に容易に沈殿するため、膜貫通タンパク質はほとんど不溶性であるため、非常に難しい（参考文献5で検討されている）。さらに、組織組成の変動性は、普遍的な抽出方法を開発する上で重要な障壁となる。最後に、臨床検体のほとんどすべてが限られているため、最小限の検体量で最大の回収率と再現性でタンパク質を調製することが不可欠です。

この研究は、プロテオーム分析のための非常に困難なサンプルである、正常ヒト心臓僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化されたプロトコールを記載する。正常な僧帽弁は、心臓の左心房と左心室との間に横たわるレックス構造（ 図1 ）。心房から心室への血流を制御し、逆流を防止し、全身への適正な酸素供給を保証し、それによって十分な心拍出量を維持するのに重要な役割を果たす。しかし、それはしばしば細胞性が低く、主に細胞外マトリックス中の成分が少ない「不活性」組織であると考えられている。これは、正常な状態では、常在性の弁間質細胞（VIC）が低いタンパク質生合成速度で静止表現型を示すためである⁷ 。

しかしながら、病理学的状態では、海綿体におけるVICの数が増加し、それらのタンパク質合成が他の機能的および表現型の変化と共に活性化されることが実証されている⁸ 。したがって、驚くべきことではない文献は、増加した数の活性化VICが同定されたタンパク質の比較的高い数を説明し得る病理学的僧帽弁^9,10の分析に焦点を当てている。

結論として、本プロトコールは、僧帽弁タンパク質成分の研究を通して、僧帽弁疾患に関与する病原機構の理解を発展させるのに役立つ可能性がある。事実、根底にある病理学的プロセスのより深い理解は、現在の介入適応症が血行力学的考察に主に基づいている弁疾患の臨床管理を改善するのに役立つ可能性がある。