İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol
Summary
İnsan mitral kapağının protein kompozisyonu halen kısmen bilinmemektedir, çünkü analizi düşük selülarite ve dolayısıyla düşük protein biyosentezi ile karmaşıktır. Bu çalışma, mitral kapak proteomunun analizi için verimli bir şekilde protein çıkarmak için bir protokol sağlar.
Abstract
Hücresel proteomun analizi, karmaşık biyolojik sistemlerde bulunan proteinlerin büyük ölçekli tanımlanmasına ve nicelenmesine olanak tanıyan teknolojilerin geliştirilmesine bağlı olarak, hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Proteomik bir yaklaşımla edinilen bilgiler potansiyel olarak bir Hastalıkların altında yatan patojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yeni tanısal ve prognostik hastalık belirteçlerinin ve umutla terapötik hedeflerin tanımlanmasına izin verilmesi. Bununla birlikte, kardiyak mitral kapak, proteoglikan ve kollajene zenginleştirilmiş hücre dışı matriste düşük sellülariteden dolayı proteomik analiz için çok zor bir örnek oluşturmaktadır. Bu, küresel bir proteomik analiz için proteinlerin çıkarılmasını zorlaştırıyor. Bu çalışma, niceliksel proteomik ve imünoblotlama gibi daha sonraki protein analizleriyle uyumlu bir protokolü açıklamaktadır. Bu, veri endeksinin korelasyonuna izin verebilirG protein ekspresyonu ile kantitatif mRNA ekspresyonu ve kantitatif olmayan immünhistokimyasal analiz verileri. Gerçekten de, bu yaklaşımlar birlikte uygulandığında, mRNA'dan translasyon sonrası proteinin modifikasyonuna kadar hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır. Bu nedenle, bu yöntem kardiyak kapak fizyopatolojisi çalışması ile ilgilenen araştırmacılarla alakalı olabilir.
Introduction
Yeni kanıtlar, mRNA sentezinden sonra ortaya çıkan birçok düzenleyici mekanizmanın rollerinin anlaşılmasını değiştirmiştir. Gerçekten de translasyonel, post-transkripsiyonel ve proteolitik süreçler protein bolluğunu ve fonksiyonunu düzenleyebilir. MRNA konsantrasyonlarının mütekabil proteinlerin yakınlıkları olduğunu söyleyen dogma, transkript seviyelerinin protein bolluğunun ana belirleyicisi olduğu varsayılarak kısmen revize edildi. Gerçekten de, transkript seviyeleri sadece protein bolluğunu kısmen tahmin ederek transkripsiyon sonrası olayların kısmen öngörülmesini sağladı. Hücrelerdeki proteinleri regüle etmek için meydana gelir 1 , 2 .
Dahası, proteinler sonuçta hücrenin işleyişini dikte eder ve bu nedenle otokrin, parakrin ve endokrin faktörlere yanıt olarak dinamik değişikliklere uğrayabilen fenotipini dikte eder; Kan yoluyla alınan arabulucular; sıcaklık; İlaç tedavisi; Ve hastalık gelişirve etkin kılar. Bu nedenle, protein seviyesine odaklanmış bir ifade analizi proteomu karakterize etmek ve hastalık patogenezinin bir parçası olarak meydana gelen kritik değişiklikleri çözmek için faydalıdır 3 .
Bu nedenle, mevcut teknolojik zorluklara rağmen, proteomiklerin sağlık ve hastalık koşullarını netleştirmek için sunduğu imkanlar çok zorludur. Proteomiklerin katkıda bulunabileceği özellikle umut verici araştırma alanları: değişen protein ekspresyonunun herhangi bir seviyede tanımlanması ( yani tüm hücreler veya doku, hücre altı bölmeleri ve biyolojik sıvılar); Hastalığın teşhisi ve prognozu için yararlı olan yeni biyolojik belirteçlerin tanımlanması, doğrulanması ve geçerliliği; Ve umarım, ilaçların etkinliği ve toksisitesinin değerlendirilmesi için olduğu kadar, terapötik amaçlar için de kullanılabilen yeni protein hedeflerinin belirlenmesi 4 .
Karmaşıklığını yakalamakProteom teknolojik zorluğu temsil eder. Mevcut proteomik araçlar, değişen protein seviyelerinin tanımlanması, nicelendirilmesi ve geçerliliği için büyük ölçekli, yüksek verimli analiz gerçekleştirme fırsatı sunar. Buna ek olarak, en bol proteinlerin neden olduğu parazitlenmeyi önlemeyi amaçlayan fraksiyonlama ve zenginleştirme tekniklerinin uygulanması, en az miktarda protein içeren protein tanımlamasını geliştirmiştir. Son olarak, proteomik, protein fonksiyonunun önemli modülatörleri olarak giderek artan translasyon sonrası modifikasyonların analizi ile tamamlanmaktadır.
Bununla birlikte, analiz altındaki biyolojik numunelerde numune hazırlama ve protein geri kazanımı hala proteomik iş akışındaki sınırlayıcı adımlardır ve muhtemel tuzaklar için potansiyel arttırır 5 . Gerçekten de, optimize edilmesi gereken moleküler biyoloji tekniklerinin çoğunda, ilk adımlar doku homojenizasyonuIyon ve hücre lizisi, özellikle amplifıkasyon yöntemleri bulunmayan düşük bolluklu proteinlerin analizi sırasında. Buna ek olarak, proteinlerin kimyasal yapısı kendi iyileşmelerini de etkileyebilir. Örneğin, çok hidrofobik proteinlerin analizi çok zordur, çünkü trans-membran proteinleri neredeyse çözünmezken, izoelektrik odaklama esnasında kolayca çökelirler (Referans 5'te incelenmiştir). Dahası, doku bileşimi değişkenliği evrensel bir ekstraksiyon yönteminin geliştirilmesi için önemli bir engel oluşturmaktadır. Son olarak, klinik örneklerin neredeyse tamamı sınırlı miktarda olduğundan, az miktarda numune miktarından maksimum düzeyde iyileşme ve tekrarlanabilirliğe sahip protein hazırlamayı sağlamak çok önemlidir 6 .
Bu çalışma, proteomik analiz için çok zor bir numuneyi temsil eden normal insan kalp kapakçık kapağından protein ekstraksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır. Normal mitral kapak bir komp.Lex yapısı sol atrium ve kalbin sol ventrikül arasında yatıyor ( Şekil 1 ). Atriyumdan ventriküle doğru kan akışının kontrolünde önemli bir rol oynar, böylece geri akış engellenir ve tüm vücuda doğru oksijen tedariki düzeyi sağlanır, böylece yeterli bir kalp debisi sağlanır. Bununla birlikte, çoğunlukla ekstrasellüler matristeki, düşük sellülarite ve birkaç bileşen içeren, "aktif olmayan" bir doku olarak kabul edilir. Bunun nedeni, normal şartlarda yerleşik valvüler interstisyel hücreler (VIC'ler), düşük bir protein biyosentez oranına sahip sessiz bir fenotiptir.
Bununla birlikte, patolojik bir durumda, spongiosa'daki VIC sayısı arttığı ve protein sentezinin diğer fonksiyonel ve fenotipik değişikliklerle birlikte aktive edildiği gösterilmiştir 8 . Bu nedenle, şurada bulunan en düşük verininLiteratürde aktif VIC'lerin artan sayısı nispeten yüksek tanımlanan proteinleri açıklayabilecek patolojik mitral kapakçıkların 9 , 10 analizine odaklanmıştır.
Sonuç olarak, bu protokol, mitral kapak proteini bileşenleri çalışması yoluyla mitral kapak hastalıklarına neden olan patojenik mekanizmaların anlaşılmasını geliştirmeye hizmet edebilir. Aslında, altta yatan patolojik süreçlerin daha iyi anlaşılması, mevcut müdahale endikasyonları büyük ölçüde hemodinamik kaygılarla yüklü olan kapak hastalıklarının klinik yönetimini iyileştirmeye yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün kritik bir adımı, numuneyi dondurmak ve öğütücü sistemini soğutmak için sıvı azot kullanılmasıdır. Sıvı azot kullanımı, biyolojik bozulmayı önler ve verimli tozlamaya izin verir, ancak güvenli kullanım için özel eğitim gerektirir.
Bu protokolde örnek öğütme için bir öğütücü sistemi bulunur, çünkü küçük numunelerin standart harç ve havanelerden kurtarılması zordur. Bu durumda, küçük numuneler, harç yüzeyinin üzerine ince bir toz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
İtalyan Sağlık Bakanlığı, bu çalışmayı destekledi (RC 2013-BIO 15). Mükemmel teknik yardımıyla Barbara Micheli'ye teşekkür ediyoruz.
Materials
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?. Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
