Summary

تشوندروسيتيس التفريق من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة البشرية المستحثة من الدم

Published: July 18, 2017
doi:

Summary

نحن نقدم بروتوكول لتوليد النسب غضروفية من الدم المحيطي البشري (ي) عن طريق الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة (إيبسس) باستخدام طريقة خالية من التكامل، والتي تشمل تشكيل الجنين (إب)، توسيع الخلايا الليفية، وتحريض غضروفية.

Abstract

في هذه الدراسة، استخدمنا خلايا الدم المحيطي (بك) كخلايا أولية لإنتاج غضروفية عن طريق الخلايا الجذعية المحفزة (إيبسس) المستحثة بطريقة خالية من التكامل. بعد تشكيل الجنين (إب) وتشكيل الخلايا الليفية الخلية، هي التي يسببها إيبسس لتمايز غضروفي لمدة 21 يوما تحت ظروف خالية من المصل وخالية من شينو. بعد تحريض غضروفية، يتم تقييم المظاهر من الخلايا من خلال التحولات المورفولوجية، المناعية، والكيمياء الحيوية، وكذلك من خلال الوقت الكمي في الوقت الحقيقي فحص ير من علامات التمايز غضروفي. الكريات تشوندروجيك تظهر الأزرق أسيان إيجابي والتلوين الأزرق تلطيخ. المناعية من الكولاجين الثاني و X تلطيخ هو أيضا إيجابية. محتوى غليكوسامينوغليكان كبريتات (سغاغ) و علامات التمايز غضروفي كولاجن 2 ( COL2كولاجين 10 ( COL10SOX9 ، أغريغكان هي أوبريغولاتد بشكل كبير في تشوندالكريات روجينيك مقارنة هبسس والخلايا الليفية. وتشير هذه النتائج إلى أن بك يمكن استخدامها كخلايا البذور لتوليد إيبسس لإصلاح الغضاريف، وهو المريض محددة وفعالة من حيث التكلفة.

Introduction

الأنسجة الغضروف لديه قدرة ضعيفة جدا لإصلاح الذاتي وتجديد. وتستخدم التدخلات الجراحية المختلفة والعلاجات البيولوجية لاستعادة الغضروف والوظيفة المشتركة، مع نتائج غير مرضية. التطور الأخير لتكنولوجيا الخلايا الجذعية قد تغير كامل مجال إصلاح الغضروف 1 . وقد تم دراسة الخلايا الجذعية المختلفة كخلايا البذور، ولكن الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) يبدو أن الخيار الواعد، لأنها يمكن أن توفر أنواع كثيرة من خلايا المريض محددة دون التسبب في ردود الفعل الرفض 2 . وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن التغلب على الطبيعة التكاثري محدود من خلايا الكبار والحفاظ على قدراتهم الذاتية التجديد والقدرات متعددة القدرات. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام استهداف الجينات لتغيير النمط الوراثي للحصول على أنواع محددة من غضروفية.

وقد استخدمت الخلايا الليفية على نطاق واسع لتوليد إيبسس لأن إمكانات إعادة البرمجة الخاصة بهم كما تم دراستها جيدا.ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود التي يجب التغلب عليها، مثل خزعة مؤلمة من المرضى والحاجة إلى التوسع في المختبر من الخلايا الليفية، والتي قد تؤدي إلى طفرات الجينات 3 . وفي الآونة الأخيرة، تبين أن لجان البرنامج والميزانية مفيدة لإعادة البرمجة 4 ؛ وعلاوة على ذلك، كانت تستخدم عادة وتخزينها بشكل واف. فمن الممكن أنها قد إعادة توجيه التركيز الدراسة من الجلد. ومع ذلك، على حد علمنا، وهناك عدد قليل من التقارير عن إعادة برمجة بك تليها التمايز إلى غضروفية.

في الدراسة الحالية، ونحن نستخدم بك كمصدر بديل عن طريق إعادة برمجة لهم في إيبسس ومن ثم التفريق إيبسس في النسب غضروفية من خلال نظام الاستزراع بيليه من أجل محاكاة تشكيل غضروفية.

Protocol

بروتوكول لتوليد هيبسس من لجان مكافحة الإرهاب يمكن العثور عليها في دراستنا السابقة 5 . تمت الموافقة على الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمؤسستنا. 1. تشكيل الجنين (إب) تشكيل <li style=";text-align:righ…

Representative Results

تشوندروجينيك التمايز من هيبسس: تم استخدام وسط تشكيل إب ووسط الثقافة القاعدية للتمييز بين هيبس في النسب الوسيطة. تم استخدام طريقة ثقافة متعددة الخطوات ( الشكل 1 ). أولا، كانت متباي?…

Discussion

هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتوليد غضروفية من بك عبر إيبسس. لأن بك هي أكثر شيوعا وتستخدم على نطاق واسع في المجال السريري، فهي تعرض كبديل محتمل لإعادة البرمجة. في هذه الدراسة، تم استخدام ناقلات عرضية (إيف) لإعادة برمجة بك في إيبسس، وفقا للطريقة التي وضعتها تشانغ وآخرون.</…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويود المؤلفون أن يشكروا زياوبين تشانغ على البلازميد. كما نشكر شاورونغ قاو وكيانفي وانغ على مساعدتهم الكريمة خلال التجربة. ويدعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (No.81101346، 81271963، 81100331)، ومشروع بكين 215 المواهب رفيعة المستوى (No.2014-3-025)، وصندوق بكين تشاو يانغ مستشفى (لا (سيكس-2017-01)، وجمعية تشجيع الابتكار الشبابية للأكاديمية الصينية للعلوم (يل).

Materials

Knockout DMEM Invitrogen 10829018 Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium
Knockout Serum Replacement (KSR) Invitrogen 10828028 A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone sh30070.03 Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture
Nonessential amino acids Chemicon TMS-001-C Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability
L-glutamine Invitrogen 35050061 An amino acid required for cell culture
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Peprotech 100-18B A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs
Dispase Invitrogen 17105041 Used for hiPSC dissociation for subculture
DMEM Gibco C11960 Basal medium used for MSC culture medium
0.1% gelatin Millipore ES-006-B Used for cell attachment onto the dishes
0.25% trypsin/EDTA Gibco 25200072 Used for cell dissociation
DPBS Gibco 14190250 A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing
β-mercaptoethanol invitrogen 21985023 Used as a growth supplement in all the cell culture medium.
ITS invitrogen 41400045 Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation.
Ascorbic acid Sigma 4403 Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property.
Sodium pyruvate Gibco 11360070 Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose.
Transforming growth factor-beta 1 Peprotech AF-100-21C A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation.
Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II Abcam ab34712 This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues.
Mouse monoclonal antibodies to Collagen X Abcam ab49945 This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes.
Permount Fisher Scientific SP15-100 For mounting and long-term storage of slides
Toluidine blue Sigma 89640 Used for proteoglycans detection.
Alcian blue Amresco #0298 Used for glucosaminoglycans detection.
Papain Sigma P4762-25MG Used to digest chondrogenic pellets.
Dimethylmethylene blue Sigma 341088-1G Used to quantitate glycosaminoglyans
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma C4384-250MG Used to draw the standard curve for sGAG content measurement.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851 (100) Used to determine DNA content
TRIzol Invitrogen 15596018 Used for RNA isolation from cells
Reverse Transcriptase System Promega A3500 Used to convert RNA into cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix Kapa KK4601 Used for Real-time PCR

References

  1. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  3. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  4. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  5. Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
  6. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  7. Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
  8. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  9. Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
  10. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  11. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
  12. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
  13. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
  14. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  15. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  16. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
  17. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  18. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  19. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  20. Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
  21. Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).

Play Video

Citer Cet Article
Li, Y., Hai, Y., Chen, J., Liu, T. Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (125), e55722, doi:10.3791/55722 (2017).

View Video