Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre
Summary
Presentamos un protocolo para generar un linaje condrogénico a partir de sangre periférica humana (PB) a través de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando un método de integración libre, que incluye la formación de células embrionarias (EB), expansión de células fibroblásticas y inducción condrogénica.
Abstract
En este estudio, hemos utilizado las células sanguíneas periféricas (PBC) como células de semillas para producir condrocitos a través de inducida por células madre pluripotentes (iPSCs) en un método de integración libre. Después de la formación del cuerpo embrionario (EB) y la expansión de las células fibroblásticas, las iPSC se indujeron para la diferenciación condrogénica durante 21 días en condiciones sin suero y sin xeno. Después de la inducción de los condrocitos, los fenotipos de las células se evalúan mediante análisis morfológicos, inmunohistoquímicos y bioquímicos, así como por el análisis cuantitativo en tiempo real de los marcadores de diferenciación condrogénica. Los gránulos condrogénicos muestran coloración alcian azul positivo y tinción con azul de toluidina. La inmunohistoquímica de la tinción con colágeno II y X también es positiva. El contenido de glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) y los marcadores de diferenciación condrogénica COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 y AGGRECAN están significativamente regulados positivamente en chondGránulos rogénicos en comparación con hiPSCs y células fibroblásticas. Estos resultados sugieren que los PBC pueden ser utilizados como células de semilla para generar iPSCs para la reparación del cartílago, que es específico del paciente y rentable.
Introduction
El tejido del cartílago tiene una capacidad muy baja para auto-reparación y regeneración. Varias intervenciones quirúrgicas y tratamientos biológicos se utilizan para restaurar el cartílago y la función de las articulaciones, con resultados insatisfactorios. El reciente desarrollo de la tecnología de células madre puede cambiar todo el campo de reparación de cartílago 1 . Varias células madre han sido estudiadas como células de semillas, pero las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSCs) parecen ser la opción más prometedora, ya que pueden proporcionar muchos tipos de células específicas del paciente sin causar reacciones de rechazo 2 . Además, pueden superar la limitada naturaleza proliferativa de las células adultas y mantener su auto-renovación y habilidades pluripotentes. Además, la orientación génica puede usarse para cambiar el genotipo para obtener tipos específicos de condrocitos.
Los fibroblastos han sido ampliamente utilizados para generar iPSCs porque sus potenciales de reprogramación también han sido bien estudiados.Sin embargo, todavía hay algunas limitaciones que deben ser superadas, como la biopsia dolorosa de los pacientes y la necesidad de la expansión in vitro de los fibroblastos, lo que puede dar lugar a mutaciones genéticas [ 3] . Recientemente, los PBCs resultaron ventajosos para la reprogramación 4 ; Además, eran comúnmente utilizados y abundantemente almacenados. Es posible que puedan reorientar el enfoque del estudio de la piel. Sin embargo, a nuestro leal saber y entender, hay pocos informes sobre reprogramación PBC seguida de diferenciación en condrocitos.
En el presente estudio, utilizamos PBCs como una fuente alternativa de reprogramar en iPSCs y luego diferenciar el iPSCs en el linaje condrogénico a través de un sistema de cultivo de pellets con el fin de imitar la formación de condrocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, proporcionamos un protocolo para generar condrocitos de PBCs a través de iPSCs. Debido a que los PBC son más comunes y ampliamente utilizados en el campo clínico, se presentan como una alternativa potencial para la reprogramación. En este estudio, los vectores episomales (EV) se utilizaron para reprogramar PBCs en iPSCs, siguiendo el método establecido por Zhang et al. 11 . Este enfoque libre de integración no implica la integración de la genotoxicidad asociada a virus, que…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Xiaobin Zhang por su plásmido. También damos las gracias a Shaorong Gao y Qianfei Wang por su amable ayuda durante el experimento. Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81101346, 81271963, 81100331), el proyecto de talento de alto nivel de Beijing 215 (No.2014-3-025) y el Fondo del Hospital Chao-Yang de Beijing (No CYXX-2017-01), y la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil de la Academia China de Ciencias (YL).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
